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氧化应激（OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡,大量生成活性氧（ROSs）进而造成细胞损伤过程。ROSs包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）以及一氧化氮（NO）等,过量ROSs会破坏核酸、蛋白质等重要大分子,造成生物膜脂质过氧化损伤,并引发和发展致癌过程。铅污染是现代环境中普遍存在的问题,铅中毒会引起机体氧化应激反应,严重会导致心血管系统、神经系统和免疫系统等损伤。对于轻微铅中毒的治疗和预防,利用抗氧化物质参与机体氧化还原反应,消除机体过量产生的自由基等活性代谢产物并同时提高机体免疫力,可避免金属离子螯合药物排铅同时排除人体有益金属元素造成的危害。超氧化物歧化酶（SOD）是自然界普遍存在的一种内源性抗氧化酶,是细胞中最强大的抗氧化剂。SOD广泛存在于动物、植物到微生物中,从动物血液中提取SOD存在致病菌传染风险,从植物、微生物中提取SOD的工艺较为复杂,得率极低且浪费人力财力资源。毕赤酵母表达系统作为一种快速经济、高效安全的外源蛋白表达系统,利用毕赤酵母表达系统获得重组SOD现已被广泛研究应用,并取得了满意成果。本研究自构建了pGAPZαMUT-Cu,Zn-SOD和pPICZα-Cu,Zn-SOD两种毕赤酵母表达体系,表达rb Cu,Zn-SOD。筛选出p PIC-SOD作为工程菌种进行表达条件优化、中试发酵培养和目的蛋白纯化,对得到的目的蛋白进行了相关酶学性质研究,还探究了重组SOD对铅中毒小鼠脏器系数、血液和组织铅浓度、机体氧化损伤及肝肾组织病理的影响。具体研究内容如下:（1）基于研究对表达载体进行适当改造并根据毕赤酵母密码子使用偏好性对牛源Cu,Zn-SOD全基因序列优化,构建重组质粒p GAPZαMUT-Cu,Zn-SOD和p PICZα-Cu,Zn-SOD,重组质粒目的基因片段双酶切电泳结果显示在487bp存在特征条带与预期相符。线性化质粒分别电转化毕赤酵母感受态细胞,利用Zeocin抗性筛选p GAP-SOD和p PIC-SOD转化子摇瓶培养,得到蛋白产物SDS-PAGE结果显示在17k Da处存在特征条带与预期相符。利用金属亲和层析对p GAP-SOD和p PIC-SOD纯化,Marklund法测定酶活性和BCA法测定蛋白含量。结果显示,p PIC-SOD酶活为423.8U/m L,蛋白含量为96.3mg/L。p GAP-SOD酶活为295.2U/m L,蛋白含量为70.2mg/L。综合选择p PIC-SOD菌株作为后续实验工程菌。纯化蛋白进行变性SDS-PAGE,重组SOD二聚体全部还原为单体,说明已成功构建表达rb Cu,Zn-SOD工程菌。（2）根据单因素实验结果,利用Box-Behnken实验设计原理以工程菌培养碳源浓度、诱导剂浓度、p H和温度作为考察因素,SOD活性作为响应值,对发酵条件进行响应面优化实验。考察因素对响应值的评分顺序是碳源浓度＞诱导剂浓度＞pH＞温度。根据实际操作确定培养条件为:碳源（葡萄糖）浓度为2.6%,诱导剂（甲醇）浓度为1.3%,p H为6.2,温度为28℃时,获得重组SOD最大酶活为638.7U/m L,是未优化前的1.5倍。（3）工程菌在50L发酵罐进行中试发酵,基于表达条件优化结果采取两段式发酵法。在菌体起始生长阶段,流加葡萄糖溶液补料6h使菌体大量生长。蛋白诱导表达阶段,流加甲醇溶液诱导表达72h结束发酵。离心收集表达上清进行超滤浓缩、亲和层析纯化、透析除盐浓缩等操作对重组SOD纯化。结果显示,发酵上清酶活为2427.1U/m L,蛋白含量为473.6mg/L。纯化蛋白SDS-PAGE显示在34k Da和17k Da处有条带与目的蛋白分子量相符,样品达到电泳纯。酶学性质研究结果显示,重组SOD在40～60℃酶活力变化稳定,温度高于70℃酶活力显著下降。重组SOD在p H 4.0～10.0酶活力变化稳定,具有较好酸碱耐受性。重组SOD对低浓度H2O2十分敏感,对低浓度SDS耐受性良好且对氯仿-乙醇具有特殊性质。（4）动物实验研究重组SOD对铅中毒小鼠的影响。腹腔注射醋酸铅溶液对小鼠进行铅中毒建模,连续4周给药不同剂量重组SOD,以杨梅素作为阳性对照组。结果显示,与模型组小鼠相比,高剂量组和阳性对照组显著改善（P＜0.05）小鼠体重和脏器系数、血液和肝肾组织铅含量、血浆和肝肾组织匀浆氧化应激相关指标MDA、SOD和GSH-Px。中、低剂量组对铅中毒小鼠氧化损伤也具有不同程度改善作用。病理组织切片观察结果显示,高、中剂量组和阳性对照组可以显著改善小鼠铅中毒造成的肝组织细胞坏死排列紊乱、细胞核增大和中央静脉充血等病理现象和肾小球萎缩及肾组织结构模糊等损伤。综上所述,本研究成功构建了rbCu,Zn-SOD毕赤酵母表达工程菌。通过对工程菌表达条件优化、目的蛋白纯化检测、中试发酵培养提高了目的蛋白产量。还探究了重组SOD相关酶学性质和对铅中毒小鼠氧化损伤的保护作用,为重组SOD后续外源表达和理论研究奠定了基础。