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目的：以Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type2, HSV-2) UL27、UL29为靶基因,构建短发夹RNA (small hairpin RNA, shRNA)重组表达载体,在体外细胞水平上观察HSV-2UL27, UL29单个靶向shRNA表达载体对病毒抑制的能力,以及联合干扰两个靶向shRNA表达载体对HSV-2复制的影响。方法：针对HSV-2UL27、UL29基因各筛选出4条拟干扰靶位点,分别构建4组抑制UL27、UL29基因的短发夹RNA的真核表达载体,以及不针对任何序列的阴性表达载体shRNA NC。通过脂质体介导重组表达载体转染HEK293细胞,48小时后再接种HSV-2。筛选出具有干扰作用的shRNA,进行联合干扰。采用实时荧光定量PCR技术检测UL27各组、UL29各组及UL27+UL29组的mRNA转录水平,终点滴定法检测细胞上清液中的各组病毒滴度,蛋白印迹法检测蛋白表达效果。结果：(1)酶切后电泳鉴定重组表达载体pGPU6/Neo-UL27、pGPU6/Neo-UL29和阴性表达载体shRNA NC;(2)实时荧光定量PCR结果显示,与空白组(未转染重组表达载体)比较,shRNA NC、UL27shRNA75组、UL27shRNA151组、UL27shRNA963组、UL27shRNA2265组抑制率分别为6.05%、75.17%、35.38%、30.74%、60.22%,各实验组与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05), shRNA NC与对照组相比无显著性差异；与空白组比较UL29shRNA897组、UL29shRNA939组、UL29shRNA1461组、UL29shRNA1653组抑制率分别为28.80%、59.95%、66.08%、36.27%,均具有显著性差异(P<0.05),其中以UL29shRNA1461组效果为最佳。UL27shRNA75联合UL29shRNA1461联合干扰组抑制率达到91.28%,(与空白组比较)具有显著性差异(P<0.05)。(3)终点滴定法结果显示UL27shRNA75组、UL27shRNA151组、UL27shRNA963组、UL27shRNA2265组、UL29shRNA897组、UL29shRNA1461组和UL27shRNA75与UL29shRNA1461联合干扰组可不同程度降低上清液中的病毒感染滴度,与空白组比较差异性显著(p<0.01)。结论：成功构建pGPU6/Neo-UL27. pGPU6/Neo-UL29重组表达载体,shRNA能在体外细胞水平上不同程度的干扰HSV-2UL27、UL29基因表达,UL27、UL29联合干扰效率更高,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制,为进一步利用RNAi技术抗HSV-2的研究提供理论依据。