急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是我国目前致死率及致残率最高的主要疾病之一,其发病率呈逐年上升趋势。近年来,AMI治疗的主要措施为经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention, PCI)和溶栓治疗,AMI治疗的关键是迅速开通梗死相关动脉(Infarct related artery, IRA),尽早恢复心肌组织血流灌注,挽救濒死心肌,缩小梗死范围,阻抑心室的重构,保护心室的功能,降低不良心血管事件(Maj or adverse cardiovascular events, MACEs)的发生,改善远期预后。然而,在早期冠脉介入治疗后,患者心外膜大血管机械性阻塞虽然已经解除,但仍有约10-30%的患者心肌组织灌注状态并未得到改善,称为“无复流现象”(No-reflow phenonmenon)。而心肌微循环障碍发生的核心因素为缺血／再灌注损伤(Ischemia/reperfusion injury, IRI),即心外膜大血管机械性阻塞开通后,心肌超微结构及代谢功能反而发生进一步损伤,因而,预防心肌的无复流现象,预防心肌缺血／再灌注损伤,成为临床面临的解决心肌梗死后心肌微循环障碍的重要课题。心肌的缺血／再灌注损伤与心肌细胞凋亡密切相关,心肌梗死急性期细胞死亡的主要表现形式即为细胞凋亡,因而早期抑制心肌细胞凋亡可明显改善心肌的缺血／再灌注损伤。山莨菪碱作为我国独有的,由茄科植物唐古特莨菪中分离出的生物碱,具有多重的药理学效应,广泛应用于临床中感染性中毒性休克、肾脏衰竭、多器官功能障碍等有微循环障碍重症疾病的抢救治疗中,发挥了重要的作用。前期研究表明,山莨菪碱可扩张微小血管,调节毛细血管前、后括约肌功能,缓解微血管痉挛,改善微循环灌注,是我国研发的调节、改善微循环的特色药物。我中心傅向华等自2001年研究表明,对于ST段抬高型心肌梗死患者行急诊PCI时,冠脉内给予山莨菪碱可有效逆转冠脉无复流现象的发生,且其机制可能与山莨菪碱改善冠脉微循环相关,后在我中心小型猪心肌梗死模型系列实验中得到证实。研究同时发现,山莨菪碱还可显著减少患者PCI术后对比剂肾病(Contrast--induced nephropathy, CIN)的发生率,显示出山莨菪碱具有多重的心肾保护作用。另一方面,山莨菪碱对于缺血/再灌注损伤的作用机制,尤其是对于细胞凋亡的影响尚缺乏进一步研究。目前临床针对心肌缺血/再灌注损伤微循环障碍的处理,仅是在术中或术后发生无复流后,给予药物或机械性治疗手段,均为“挽救性干预治疗”。有鉴于此,我中心首次提出,在开通IRA前进行药物性干预,使梗死相关区域心肌微循环做出再灌注适应性调节反应,减轻和预防IRA开通后缺血/再灌注损伤, 即“预防性干预治疗”理念和方法,以期进一步预防和减少无复流的发生,改善心肌微循环的灌注。。本研究以前期研究为基础,着重探讨预防性应用山莨菪碱对急性心肌梗死后缺血/再灌注损伤的防治作用。本系列研究共分为五个部分：第一部分以临床急性ST段抬高型心肌梗死患者为研究对象,探讨冠脉内预防性应用山莨菪碱对直接PCI术后心肌再灌注和心功能的保护效应；第二部分建立大鼠急性心肌梗死模型,再灌注前预防性静脉给予山莨菪碱,观察大鼠心肌梗死面积、心肌超微结构、梗死后心肌损伤标志物及ATP、MDA和SOD水平变化,进一步探讨预防性应用山莨菪碱对于心肌缺血/再灌注损伤的改善作用,并观察细胞组织凋亡相关蛋白的改变。第三部分使用大鼠H9c2心肌细胞,制作模拟急性心肌梗死时的缺氧/复氧模型,探讨山莨菪碱对于细胞凋亡产生的影响及其作用的分子学机制。第四部分联合应用山莨菪碱及rhBNP,观察其对直接PCI术后合并心力衰竭患者心肌再灌注和心功能的保护相应及两种药物联合的交互效应。第五部分探讨rhBNP对患者肾功能的产生影响及是否存在保护作用。第一部分预防性冠脉内应用山莨菪碱对急性ST段抬高心肌梗死直接PCI术后心肌灌注的保护效应目的：观察急性ST段抬高心肌梗死(STEMI)行直接经皮冠状动脉介入治疗(pPCI)中,在梗死相关动脉(IRA)预防性冠脉内应用山莨菪碱,对患者心肌再灌注及心功能的影响。方法：入选2012年10月至2014年2月收入河北医科大学第二医院心内科的发病12h内行直接PCI治疗的ST段抬高型心肌梗死患者纳入本研究。将入选患者随机分为山莨菪碱组(ANI group), IRA开通前预防性冠脉内给予山莨菪碱2000μg/10ml;对照组(CON group)冠脉内给予等容积生理盐水。所有患者均经前臂动脉入径行冠状动脉造影(CAG)检查及PCI介入治疗。由两名以上经验丰富的心脏病专家进行量化的冠脉造影灌注指标判定,包括初始及术后TIMI血流,TIMI,心肌灌注分级(TMPG),校正的TIMI血流计帧(CTFC)。术前及术后每6小时检查心肌坏死标记物,以峰值CK-MB间接评估患者心肌梗死面积。术前及术后90 min记录患者心电图,以ST段回落(STR)评价术后心肌再灌注水平,计算两组完全STR(术后90min时心电图ST段抬高之和较入院时下降≥70%)比例。随访观察两组患者3个月主要不良心血管事件(MACEs)发生的差异。使用SPSS 16.0软件进行数据统计,以P值<0.05认为有统计学意义。结果：共计入选患者118例,其中ANI组58例,CON组60例。两组患者在术前血栓积分分布以及基线TIMI血流分级无显著差异,但PCI术后ANI组TIMI 3及TMPG 3比例显著高于CON组(TIMI血流3级：91%vs.75%,P=0.039；TMPG 3级：84% vs.65%,P=0.044)。ANI与CON两组患者入院时基线CK-MB水平无统计学差异,但冠脉内给予山莨菪碱后,患者术后CK-MB峰值显著降低,曲线下面积(AUC)较CON组减少24.18%,有统计学意义。两组患者入院基线LVEF无统计学差异,而术后7天时,ANI组LVEF为57.22±8.19%,CON组LVEF为53.17±6.18%,两组统计学差异显著(P=0.003)。术后30天时,ANI组LVEF为62.52±8.27%,CON组LVEF为59.12±9.31%,有统计学差异(P=0.038)。随访3个月结果显示,ANI组共2例患者MACEs事件,而CON组共计5例,两组均无死亡患者,且两组间比较无显著统计学差异(P=0.433)。结论：预防性冠脉内应用山莨菪碱可显著改善STEMI患者pPCI术后心肌灌注水平,减少心肌梗死面积,改善患者预后。第二部分预防性应用山莨菪碱对大鼠心肌缺血／再灌注损伤后心肌保护作用及凋亡影响的研究目的：观察预防性应用山莨菪碱对心肌缺血／再灌注大鼠的心肌保护作用及心肌细胞凋亡的影响。方法：将54只Sprague-Dawley (SD)大鼠随机分为三组,分别为假手术(SO)组,缺血／再灌注(I/R)组,缺血／再灌注山莨菪碱(ANI)组。SO组仅在大鼠心脏前降支起点2-3 mm处穿线不结扎；I/R组结扎大鼠心脏前降支40min后,松解结扎线再灌注3h；ANI组再灌注前静脉给予山莨菪碱。所有大鼠再灌注结束后,使用TTC(2,3,5—氯化三苯基四氮唑)染色计算大鼠心肌梗死面积,取静脉血检测心肌坏死标志物LDH,CK-MB含量,测量梗死后心肌ATP、MDA及SOD浓度,并使用透射电镜观察心肌超微结构改变。使用Western-blot分析法观察梗死心肌凋亡相关因子caspase-3, caspase-8及caspase-9的蛋白表达。结果：各组大鼠周龄及体重比较均无统计学差异,具备可比性。假手术各组心肌均呈现暗红色,无白色梗死区域出现。与SO组相比较,I/R组大鼠心肌梗死面积显著增加(49.94±9.58%),而给予山莨菪碱预处理的大鼠,心肌梗死面积较I/R组显著减小(31.56±7.46%),具有统计学意义(P=0.004)。与SO组比较,I/R组大鼠血清LDH、CK-MB均显著增高(P<0.001),而预防性应用山莨菪碱后,ANI组大鼠血清LDH与I/R组比较显著降低(1753.93±80.96 U/L vs.2322.45±91.46 U/L,P<0.001),有统计学意义。ANI组大鼠CK-MB较I/R组显著降低(1979.88±177.38vs.2938.11±164.28 U/L,P<0.001),有统计学意义。应用山莨菪碱后,ANI组ATP及SOD水平较I/R组显著升高,而MDA水平降低(P<0.05)。使用透射电镜观察心肌组织显示：SO组心肌超微结构基本正常,I/R组心肌组织超微结构损伤较重,心肌纤维肌节消失,线粒体重度水肿,模糊不清,部分空化,线粒体融合模糊不清或消失,线粒体嵴断裂缺失。ANI组心肌细胞损伤与I/R组比较明显减轻,线粒体部分轻度水肿,嵴突数目减少,肌纤维间轻度水肿,糖原颗粒轻度减少。结论：预防性应用山莨菪碱可显著减少缺血/再灌注大鼠心肌梗死面积,减轻心肌超微结构损伤,降低心肌损伤标志物水平,增加心肌梗死后ATP能源供给,并可显著减少caspase-3, caspase-8凋亡因子蛋白表达,减少大鼠急性心肌梗死后细胞凋亡。第三部分 预防性应用山莨菪碱对H9c2心肌细胞缺氧/复氧后凋亡的影响及其机制研究目的：探讨使用山莨菪碱预处理缺氧/复氧大鼠H9c2心肌细胞时,山莨菪碱对其凋亡的影响及相关机制。方法：H9c2心肌细胞接种于25cm2培养瓶中,待长满至融合度约90%时,随机分为三组,分别为对照(CON)组：心肌细胞正常培养；缺氧／复氧(H/R)组,心肌细胞缺氧培养3小时后,正常培养基复氧培养12小时；山莨菪碱(ANI)组：缺氧培养3小时后,换入含山莨菪碱的培养基复氧培养12小时。使用磺酰罗丹明B比色法(SRB)检测心肌细胞活性,原位末端标记法(TUNEL)染色观察细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡后DNA片段断裂情况。磷脂肽结合蛋白V(Annexin V)联合碘化丙啶(PI)双染法和流式细胞学技术分析各组H9c2心肌细胞缺氧／复氧后凋亡变化。提取细胞总蛋白,使用BCA法测定细胞蛋白质浓度,使用Western-blot法测定细胞凋亡蛋白caspase-3, caspase-8, Bcl-2及Bax的蛋白表达水平,并使用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定相关caspase-3, caspase-8, Bcl-2及Bax的mRNA水平。结果：H/R组的H9c2心肌细胞活力显著下降,而山莨菪碱预处理后缺氧／复氧心肌细胞的活力显著增高。CON组可见少量棕黄色深染的TUNEL阳性细胞(即凋亡细胞),H/R组的凋亡细胞明显增多,而经山莨菪碱预处理后,凋亡细胞数量较H/R组显著减少。H/R组H9c2心肌细胞caspase-3的蛋白和mRNA表达水平显著增加,与CON组比较具有统计学差异(P<0.05)；ANI组与H/R组比较,caspase-3的蛋白和mRNA表达水平明显减少(P<0.05)。各组间Caspase-8蛋白和mRNA表达水平的变化同caspase-3。H/R组Bcl-2的蛋白和mRNA表达水平较CON组显著增加,但山莨菪碱预处理明显提高了Bcl-2的水平。H/R组Bax的蛋白和mRNA表达水平较CON组显著增加,而ANI组Bax表达较H/R组显著下降。结论：山莨菪碱预处理可明显减少H9c2心肌细胞H/R损伤后的细胞凋亡,其机制可能通过下调caspase-3, caspase-8及Bax的蛋白和mRNA水平,上调Bcl-2蛋白及mRNA表达水平来实现。第四部分预防性应用山莨菪碱联合rhBNP对ST段抬高心肌梗死患者早期PCI心肌灌注改善作用的研究目的：探讨在急性ST段抬高心肌梗死(STEMI)合并心力衰竭患者行直接经皮冠状动脉介入治疗(pPCI)中,预防性联合应用山莨菪碱及rhBNP对患者心肌再灌注及心功能的作用。方法：入选2014年2月至2015年2月收入河北医科大学第二医院心内科的发病12h内行直接PCI治疗的ST段抬高型心肌梗死患者共计96例纳入本研究。将入选患者随机分为对照组(单纯PCI组)、山莨菪碱组(ANI组)组、重组人脑利钠肽组(rhBNP组)和山莨菪碱联合重组人脑利钠肽组(ANI+rhBNP组)。山莨菪碱给药方式为：IRA开通前预防性冠脉内给予山莨菪碱2000 μg/10ml; rhBNP给药方式为术前及静脉给予1.5μg/kg负荷量,以0.0075μg/kg/min低剂量维持静脉泵点至术后72h。所有患者均经前臂动脉入径行冠状动脉造影(CAG)检查及PCI介入治疗。由两名以上经验丰富的心脏病专家进行量化的冠脉造影灌注指标判定,包括初始及术后TIMI血流,TIMI心肌灌注分级(TMPG),校正的TIMI血流计帧(CTFC)。术前及术后每6小时检查心肌坏死标记物,以峰值CK-MB间接评估患者心肌梗死面积。术前及术后90 min记录患者心电图,以ST段回落(STR)评价术后心肌再灌注水平,计算两组完全STR(术后90min时心电图ST段抬高之和较入院时下降≥70%)比例。使用SPSS16.0软件进行数据统计,以P值<0.05认为有统计学意义。结果：四组患者在术前血栓积分分布以及基线TIMI血流分级无显著差异,但PCI术后ANI组、rhBNP组和ANI+rhBNP组患者TMPG 3比例增高(P=0.039)四组患者入院时基线CK-MB水平无统计学差异,术后ANI组、rhBNP组和ANI+rhBNP组患者CK-MB峰值较CON组显著降低(P<0.001)。且交互作用分析显示,山莨菪碱和rhBNP可能对患者心肌梗死面积的减少存在协同交互效应。术后7天LVEF显示,ANI组、rhBNP组和ANI+rhBNP组患者术后LVEF显著提高(P=0.004),有统计学意义。随访3个月结果显示,CON组共4例患者发生MACEs事件,ANI组发生1例,rhBNP组2例,ANI+rhBNP组1例。四组间比较无统计学差异。结论：PCI前预防性应用山莨菪碱及rhBNP均可改善冠脉微循环及心肌灌注；山莨菪碱和rhBNP在减少心肌梗死面积方面可能存在协同作用。第五部分重组人脑利钠肽在接受急诊PCI治疗的急性心肌梗死心力衰竭伴轻度肾功能不全患者中应用肾功能的安全性研究目的：探讨重组人脑利钠肽对急性ST段抬高心肌梗死心力衰竭(STEMI-HF)伴轻度肾功能不全患者急诊经皮冠状动脉介入治疗(pPCI)后的肾功能的影响。方法：连续入选于河北医科大学第二医院心内五科行急诊PCI的急性ST抬高心肌梗死心力衰竭伴轻度肾功能不全患者。术前随机应用重组人脑利钠肽(rhBNP group)或硝酸甘油(NIT group),观察PCI术前及术后患者血清肌酐(SCr)、估测肾小球滤过率(eGFR)、胱抑素-C(Cys-C),p2微球蛋白水平变化以及计算术后72小时内患者CIN的发生率。CIN定义为接触对比剂的72小时内,血清肌酐绝对值升高≥44.2μmol/L或与基础值相比升高≥25%。采用多因素logistic回归分析各因素与CIN发生的相关性。结果：共入选患者116例,其中rhBNP组57例,NIT组59例。rhBNP组患者与NIT组患者比较,在急诊PCI术后两组患者的SCr、eGFR以及β2微球蛋白比较无统计学差异(均P>0.05)。rhBNP组术后24及72小时Cys-C较NIT组显著降低,且72小时总尿量较NIT组增加。rhBNP组CIN发生率较NIT组显著降低(12.28% vs.28.81%,P<0.05)。两组随访死亡率及再住院率无显著差异。结论：rhBNP对STEMI-HF伴轻度肾功能不全患者pPCI术后的肾功能损伤无显著影响。应用rhBNP可显著降低STEMI-HF轻度肾功能不全患者pPCI术后CIN的发生率。