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目的:砷广泛存在于自然界中,是国际公认的致癌物和环境污染物。环境砷污染是一个严重的公共卫生问题,主要与饮用砷污染的地下水有关。全球有近9400万至2.2亿人存在地下水高砷暴露的风险,其中94%人口分布在亚洲,中国有近2千万人饮用高砷水。长期环境砷暴露能引发多种疾病,而皮肤是人体的第一道保护屏障,也是对砷毒性最敏感的器官之一。大量流行病学调查显示,砷暴露可引发多种类型的皮肤损害,皮肤病变的患病率和发病率与饮用水中砷含量、暴露时间呈正相关,但其毒性作用机制尚不明确。自噬是广泛存在于真核细胞中通过溶酶体机制降解自身成分的一种代谢途径,是细胞在外界压力或者营养缺乏条件下的一种自我保护机制。“自噬流”代表自噬的动态发展过程,包括自噬小体的形成、成熟、与溶酶体的融合、降解。大量文献报道自噬异常参与很多疾病的病理生理过程。以往研究表明,砷能够诱导自噬的发生,但不同程度的砷暴露对不同细胞自噬通路的影响可能是不同的。关于急性砷暴露对人角质形成细胞自噬的影响及与细胞损伤的关系尚不清楚。本研究应用永生化人角质形成细胞Ha Ca T细胞,研究急性砷暴露诱发Ha Ca T细胞自噬改变与细胞损伤的关系。另外,氧化应激是砷暴露最主要的致病机制之一,因此我们进一步研究了急性砷暴露诱发的Ha Ca T细胞自噬改变与氧化应激之间的作用关系。研究方法:1.通过Western Blot检测不同剂量、时间的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中P62、LC3的蛋白水平;通过透射电子显微镜观察不同时间的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中的自噬小体。2.通过Western Blot检测不同剂量、时间的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中LAMP1、LAMP2的蛋白水平;通过病毒转染技术和荧光倒置显微镜检测不同剂量的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中m RFP-GFP-LC3荧光信号水平;通过荧光倒置显微镜检测急性砷暴露后细胞中溶酶体探针Lyso Tracker Red荧光信号水平。3.通过荧光倒置显微镜检测不同剂量的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中p H敏感型溶酶体探针Lyso Sensor Blue的荧光信号水平;通过RT-q PCR检测不同剂量、时间的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中CTSB、CTSD、RAB7的m RNA水平;通过Western Blot检测不同剂量、时间的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中CTSB、CTSD、RAB7的蛋白水平;通过CTSD活性检测试剂盒检测不同剂量的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中CTSD活性变化;通过透射电子显微镜观察不同剂量的急性砷暴露后Ha Ca T细胞中的残余体(髓样小体)。4.通过MTS法和倒置显微镜检测不同剂量的急性砷暴露后Ha Ca T细胞活性和形态改变;通过MTS法、Western Blot和TUNEL染色检测自噬激活和抑制状态下不同剂量的急性砷暴露后Ha Ca T细胞活性和凋亡水平。5.通过流式细胞仪和荧光倒置显微镜检测不同剂量的急性砷暴露和抗氧化剂NAC干预后Ha Ca T细胞中活性氧水平和DCFH-DA荧光信号强度;通过MTS法和倒置显微镜检测NAC干预后Ha Ca T细胞活性和形态改变。6.通过Western Blot检测NAC干预后Ha Ca T细胞中P62、LC3、LAMP1、LAMP2蛋白水平。7.通过荧光倒置显微镜观察NAC干预后Ha Ca T细胞中p H敏感型溶酶体探针Lyso Sensor Blue的荧光信号水平;通过RT-q PCR和Western Blot检测NAC干预后Ha Ca T细胞中CTSB、CTSD、RAB7的m RNA与蛋白水平;通过CTSD活性检测试剂盒检测NAC干预后Ha Ca T细胞中CTSD活性变化;通过透射电子显微镜观察NAC干预后Ha Ca T细胞中的髓样小体数量变化。结果:1.急性砷暴露诱导Ha Ca T细胞自噬发生,P62、LC3蛋白水平和LC3转化率均呈剂量、时间依赖性增加;透射电子显微镜下观察到急性砷暴露后Ha Ca T细胞中自噬小体数量明显增多。2.急性砷暴露后Ha Ca T细胞中自噬溶酶体生成增多,LAMP1、LAMP2蛋白水平呈剂量、时间依赖性增加;溶酶体探针Lyso Tracker Red荧光信号明显增强,说明急性砷暴露促进Ha Ca T细胞中溶酶体的生物发生;m RFP-GFP-LC3荧光结果中观察到黄色荧光斑点,说明砷暴露后Ha Ca T细胞中自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。3.急性砷暴露后Ha Ca T细胞中p H敏感型溶酶体探针Lyso Sensor Blue的荧光信号显著增高,说明溶酶体酸性增强;溶酶体中组织蛋白酶CTSB、CTSD的m RNA和蛋白水平均呈剂量、时间依赖性降低,RAB7的m RNA和蛋白水平均明显增加;CTSD活性呈剂量依赖性下降;透射电子显微镜下观察到大量髓样小体,髓样小体的数量随着砷暴露剂量的增加而增多,说明急性砷暴露影响溶酶体的活性和功能导致自噬溶酶体降解异常。4.急性砷暴露引起Ha Ca T细胞活性降低和形态改变,呈剂量依赖性;自噬激活剂Rap的干预使细胞活性进一步降低并促进凋亡,自噬抑制剂3-MA的干预使细胞活性升高并减少凋亡。5.急性砷暴露后Ha Ca T细胞内ROS水平大幅上升,而抗氧化剂NAC干预后ROS水平显著下降,DCFH-DA荧光明显减弱;NAC干预后Ha Ca T细胞活性显著升高,因损伤造成的细胞形态改变也明显缓解,说明急性砷暴露通过氧化应激造成Ha Ca T细胞损伤。6.与单独急性砷暴露相比,抗氧化剂NAC干预后Ha Ca T细胞中P62、LC3、LAMP1、LAMP2蛋白水平明显减少,LC3转化率显著降低,说明拮抗氧化应激可以降低Ha Ca T细胞的自噬水平。7.与单独急性砷暴露相比,抗氧化剂NAC干预后Ha Ca T细胞中p H敏感型溶酶体探针Lyso Sensor Blue的荧光信号显著降低,缓解了急性砷暴露造成的溶酶体酸性增强;溶酶体中CTSB、CTSD的m RNA和蛋白水平显著增加,RAB7的m RNA和蛋白水平明显下降;CTSD活性明显升高;透射电子显微镜下髓样小体的数量大幅减少,说明拮抗氧化应激减轻了急性砷暴露造成的自噬溶酶体功能异常。结论:1.急性砷暴露通过诱发自噬溶酶体降解功能损伤,导致Ha Ca T细胞自噬异常。2.急性砷暴露导致的自噬异常参与Ha Ca T细胞损伤。3.抗氧化剂NAC能够通过拮抗氧化应激减轻急性砷暴露所致的Ha Ca T细胞自噬异常。