微孢子虫(Microsporidia)是一类具有70S型核糖体的、专性细胞内寄生的单细胞真核生物,广泛寄生于昆虫、鱼、兔、产毛动物、啮齿类及灵长类。第一个被人类认识微孢子虫种是家蚕微孢子虫,它由Nageli在1857年于家蚕中发现并命名,此后陆续有很多新的种类被分离鉴定,迄今已有超过160个属1300多种。1959年在免疫缺陷型病人体内发现了微孢子虫,后来发现有8属14个种可以感染人类,特别是免疫缺陷型病人。自从发现微孢子虫可以感染人类后,科学界歼始对微孢子虫高度关注。过去微孢子虫曾被认为是没有线粒体的原始的真核生物,但近年来的研究推翻了这种观点,NCBI中将微孢子虫归属于真菌类,其呈现出较为原始特征的原因被认为是经历了简化进化的过程;同时,有学者通过实验证明微孢子虫具有简化的线粒体细胞器——“线体”。家蚕微孢子虫是微孢子虫属的典型种,由它引发的家蚕微粒子病是蚕业生产上的毁灭性病害,而对微粒子病的防控目前还没有有效的方法,这也是蚕学界当前研究的重点和难点。1968年,Ishihara和Hayashi通过蔗糖密度梯度超速离心发现微孢子虫核糖体具有原核特征,其具有原核生物特有的70S核糖体由50S和30S两个亚基组成。微孢子虫作为一种真核生物,却具有原核型特征的核糖体,这一现象产生的原因还不清楚。1994年,日本学者认为家蚕微孢子虫只有一个rDNA拷贝,这与其它微孢子虫有很大差异。近年来,我们通过全基因组霰弹法对家蚕微孢子虫CQ1株进行全基因组测序,有机会对其核糖体蛋白及rDNA进行全景式的分析,以期回答微孢子虫核糖体的相关问题。　　 本研究主要通过核糖体蛋白基因与rDNA序列两方面进行家蚕微孢子虫核糖体的全面分析,首先对基因组中的核糖体蛋白基因进行鉴定及其在基因组中的分布情况和不同微孢子虫间的基因组排布进行分析;对rDNA的研究主要集中在rDNA在基因组中的分布情况和rDNA在染色体上的定位分析,不同地区来源的家蚕微孢子虫的rDNA序列的多态性,以及家蚕微孢子虫被MITEs元件插入后其活性的研究等方面进行开展;最后,利用同多个物种间序列与结构分析的结果进行了家蚕微孢子虫70S核糖体成因的初步探讨。　　 1.家蚕微孢子虫核糖体蛋白基因的鉴定与分析　　 通过全基因组扫描与同源序列比对,我们在家蚕微孢子虫基因组中共鉴定出130条核糖体蛋白序列,它们对应于73个核糖体蛋白基因,其中大亚基蛋白43个,小亚基蛋白30个;其中有三个核糖体蛋白基因含有较短的内含子,通过其对应的EST序列得到了证明,并且这些内含子的结构同其它微孢子虫中核糖体蛋白内含子的结构一致。对核糖体蛋白上游500bp的序列进行了启动子和调控元件预测,发现在这些序列中存在保守的"AAATTT-like signal-CCC-like(or GGG-like)motif-transcription start site"的典型排布;SP1、GATA-1等调控基序在核糖体蛋白基因上游是广泛存在的。在所有的家蚕微孢子虫核糖体蛋白中,有56种(约占76.7％)存在于多种微孢子虫序列的共线性区段内,表明这些基因的排布在微孢子虫内是比较保守的。通过核糖体蛋白基因系统进化树的分析,我们发现结果同用rDNA序列构建的进化树一样——微孢子虫仍是位于真核生物的基部。　　 2.家蚕微孢子虫核糖体DNA的序列多态性及rDNA在染色体上的定位　　 利用家蚕微孢子虫基因组数据,通过生物信息学分析软件RepeatMasker软件对全基因组进行扫描,在家蚕微孢子虫基因组中共检测到42个LSU rDNA、40个SSU rDNA和37个5S rDNA单元。利用Southern杂交技术,分别以rDNA片段的三个不同部分制备探针进行了杂交,获得了较为一致的结果:三个片段均定位于家蚕微孢子虫的所有染色体上,因此我们得出家蚕微孢子虫的rDNA序列在家蚕微孢子虫的所有染色体上均存在。同时,我们对从不同地方收集到的家蚕微孢子虫株系,对rDNA区的序列多态性进行研究。结果表明,广东、广西、重庆与云南等地区家蚕微孢子虫种内存在较为明显的遗传分化,产生这一结果的原因可能与传代过程中的遗传变异有关,也可能与家蚕微孢子虫寄生宿主的组织特异性有关。同时,四川地区家蚕微孢子虫单独聚为一枝,说明家蚕微孢子虫也存在一定程度的地理种群差异;而重庆、广东、广西与云南等地区家蚕微孢子虫的遗传混杂可能是不同地区微孢子虫相互交叉传播引起的。家蚕微孢子虫种内rDNA序列多态性表明家蚕微孢子虫具有多样的和复杂的遗传背景,这可能是其在进化过程中形成的一种适应性,以抵御不良的环境因素,同时对维持家蚕微孢子虫种群的生存和繁殖具有重要的生物学意义。曾有报道说明微孢子虫的基因序列比真菌基因序列变异速率快,因此家蚕微孢子虫ITS和IGS区序列差异较大,是容易理解的。本研究的结果表明家蚕微孢子虫rDNA区在种内存在着遗传多样性,并且具有一定的地域性差异,这种遗传多样性可能源于三种因素:微孢子虫传代过程中的遗传变异、微孢子虫寄生的宿主组织特异性、以及对不同地理环境的适应性。　　 3.家蚕微孢子虫中含MITEs插入的rDNA序列的活性研究　　 我们鉴定了家蚕微孢子虫的四个插入rDNA序列中的MITEs家族,通过分析发现这些插入元件具有典型的MITEs元件的共有特征:高AT含量和末端序列重复(TSD),但这些MITEs插入序列的来源尚不清楚。根据家蚕微孢子虫核糖体RNA中核苷酸的排序和含有MITEs插入的核糖体RNA的二级结构分析,我们发现SSUME1位于变异区V2,SSUME2位于变异区V4,LSUME1位于序列扩增区D9区。在本研究中,我们对rDNA中的四种MITEs插入(LSUME1,ITSME1,SSUME1与SSUME2)均进行了相关研究,利用Northern杂交技术对转录后的RNA进行了检测,结果发现只有三种插入存在杂交信号,而ITSME1没有检测到杂交信号。这可能是ITS rRNA在转录后很快就被剪切和降解掉了。非常有趣的是,利用点杂交的结果进一步表明这些含有MITEs插入序列的rDNA能够转录,并且能够组装到核糖体内部。在家蚕微孢子虫rDNA序列中鉴定的MITEs插入情况中,核糖体RNA的核苷酸排列顺序与二级结构分析表明这些插入位于高变异区,这些位置可能对核糖体的功能不会产生重要的影响,这可能也是这种MITEs插入存在并能转录和组装的重要原因。　　 4.家蚕微孢子虫70S核糖体形成机制初探　　 从家蚕微孢子虫核糖体RNA与核糖体蛋白两个方面进行分析,通过rDNA序列长度在不同物种间的比较发现微孢子虫rDNA序列长度是最短的,进一步的二级结构比较发现家蚕微孢子虫的rRNA在茎环结构上也存在一定程度的减少。通过对核糖体蛋白不同物种间的同源序列比较分析发现:家蚕微孢子虫核糖体蛋白序列长度大多介于原核生物与真核生物之间;通过核糖体蛋白二级结构的比较分析,我们发现家蚕微孢子虫核糖体蛋白中α螺旋和β-折叠的数目较对应的典型的真核生物的略少。根据对核糖体相关基因的序列与结构分析,可以得出家蚕微孢子虫核糖体在其序列和结构上都存在不同程度的减缩,而这种减缩则形成了这种真核生物中存在70S核糖体的特殊情况。