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笼养蛋鸡骨质疏松症是以全身渐进性结构骨丢失及骨脆性增加和易于发生骨折为特征的一种严重骨骼性疾病。笼养、营养、遗传、内分泌等对本病的发生均有一定的作用,但其确切作用机制仍不明了。鉴于IGF-Ⅰ是骨骼中最丰富的生长因子、并对骨重建动态平衡起着重要的调节作用,本丈从IGF-Ⅰ的成骨细胞生物学功能及IGF-Ⅰ遗传多态性两个方面展开研究,旨在部分阐明笼养蛋鸡骨质疏松症的发生机制。 1、鸡胰岛素样生长因子Ⅰ的克隆及其在大肠杆菌中的表达 根据GenBank上发表的鸡(Gallus gallus)胰岛素样生长因子-Ⅰ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR方法从雏鸡肝脏总RNA中扩增出鸡IGF-Ⅰ基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定及DNA序列测定。结果表明,扩增片段为含有信号肽的鸡IGF-Ⅰ完整基因,与GenBank上登录的鸡IGF-Ⅰ(M-32791)同源性为100%。在此基础上,亚克隆鸡IGF-Ⅰ成熟蛋白编码基因,然后构建了鸡IGF-Ⅰ原核单纯表达载体pRLC-IGF-Ⅰ,再通过温度诱导实现了重组鸡IGF-Ⅰ成熟蛋白的表达,经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,原核表达产物为7.6KD的重组蛋白,薄层扫描显示IGF-Ⅰ占菌体总蛋白的23%。重组鸡IGF-Ⅰ的获得为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 2、鸡IGF-1重组蛋白的变、复性研究及生物学活性测定 在重组IGF-Ⅰ获得高表达的基础上,收集诱导表达5h后的大肠杆菌DH5α菌液,超声波裂解细菌,Tricine-SDS-PAGE电泳显示,pRLC-IGF-Ⅰ表达质粒的表达产物仅存在于包涵体中。经7mol/L盐酸胍的变性液溶解及含0.5mol/L精氨酸复性液处理,表达产物随后进行脱盐、凝胶层析纯化。MTT法分析其对NIH3T3和鸡胚成纤维细胞的增殖效应。结果表明:重组鸡IGF-Ⅰ在100-800ng/mL范围内,显著促进NIH3T3和鸡胚成纤维细胞的增殖作用。结论:重组IGF-Ⅰ具有较高的生物学活性。 3、鸡胚额骨成骨细胞分离培养及重组鸡IGF-Ⅰ对其促增殖作用的研究 在建立鸡胚额骨成骨细胞培养方法的基础上,体外直接研究重组鸡IGF-Ⅰ对蛋鸡成骨细胞增殖和分化功能的影响。剔取15日龄鸡胚颅骨,剪碎,采用酶消化法(0.1%Ⅱ型胶原酶)获取鸡胚额骨成骨细胞群并鉴定。经培养传代,取状态良好的第二代细胞于96孔板上进行重组鸡IGF-Ⅰ作用下增殖率和碱性磷酸酶活性的测