葱蝇Delia antiqua属双翅目(Diptera)、花蝇科(Anthomyiidae)、地种蝇属(Delia)昆虫,是世界性广泛分布的百合科植物害虫。葱蝇是目前已知的少数兼具夏滞育与冬滞育特性的昆虫之一,具有很强的环境适应性。葱蝇可以在实验室用人工饲料大规模饲养,同时在系统发育上与黑腹果蝇Drosophila melanogaster近缘,因而成为昆虫滞育比较研究的理想模式种。滞育是昆虫主动应对不良环境的一种发育上的适应机制。目前对葱蝇滞育的研究主要集中于对其生物学、生理生态学、滞育与非滞育个体形态学与滞育调控分子机制比较、滞育终止的遗传和环境控制等方面,处于最上游的滞育诱导的分子调控机制仍不清楚。本研究以葱蝇作为研究材料,通过不同光周期和温度条件组合确定葱蝇滞育诱导的最佳环境条件,明确温度和光周期在葱蝇滞育诱导中的作用;通过转录组测序,比较非滞育和夏滞育诱导敏感期转录组动态变化差异,分析代谢通路,筛选出可能与葱蝇滞育诱导相关的基因;通过qRT-PCR对重要基因的表达模式进行分析,为探讨它们在葱蝇滞育诱导调控中的作用提供参考。主要研究结果呈现如下:(1)以葱蝇为模式种建立了冬滞育、夏滞育与非滞育比较研究的模式昆虫系统,通过不同温度和光周期组合对葱蝇进行滞育诱导,明确了滞育诱导的温度和光周期效应及冬滞育、夏滞育和非滞育诱导的最优条件。在16℃,18℃和20℃条件下,葱蝇滞育率随日长缩短而显著增加。在LD16:8长光照条件下,低温诱导的滞育率低,随着光照时数缩短,滞育率呈逐渐增加趋势。光期较长或较短时滞育率都很高,只有在较窄的光照范围内绝大多数个体不滞育。在日长>10 h,22,24和26°C条件下以及日长<12 h,16,18和20°C条件下,全部或大部分个体进入滞育。日长>16h时,22,24和26°C下的滞育率差异不显著,当日长<12h时,随温度的升高滞育率下降,可见温度对葱蝇滞育诱导的影响伴随着光周期的作用而作用,只有当日长<16h才能显现温度对滞育诱导的影响。结果表明葱蝇滞育属于典型的长日-短日反应型,光周期在冬滞育诱导中起主导作用,温度伴随着光周期起作用,而夏滞育诱导主要受到温度的调控。(2)确定了幼虫的三个龄期及滞育诱导的敏感阶段。根据头咽骨和口钩的长度的变化规律,结合前后气门的形态特征变化,确定了幼虫具有发育整齐的三个龄期。用抑制滞育效应的环境条件20℃,LD16:8和诱导滞育的环境条件26℃,LD16:8检验滞育诱导的敏感阶段。26°C,LD16:8饲养的卵和幼虫自卵产下当天起逐日转移到20°C,LD16:8条件下,同时,20°C,LD16:8饲养的卵和幼虫自卵产下当天起逐日转移到26°C,LD16:8条件下。根据每组处理的蛹滞育率推测夏滞育和非滞育幼虫对温度最敏感时期分别为三龄第9天幼虫和第4天幼虫。这为下一步RNA测序精确的取样点提供依据。(3)通过高通量RNA测序比较夏滞育和非滞育诱导最敏感时期的转录差异,鉴定葱蝇夏滞育诱导相关的基因和生理过程。结果表明葱蝇差异表达的基因以不同结构、调控、代谢和转运蛋白为主,夏滞育诱导可能的调控子与昼夜周期节律、热敏感性和免疫防御有关。热激蛋白Hsps和昼夜节律钟基因在葱蝇滞育诱导中有潜在的重要作用。1)在三个授时时间点——2:00,10:00和18:00;26±0.5°C,LD16:8和20±0.5°C,LD16:8饲养条件下的三龄第9天和第4天幼虫在上述三个时间点分别进行取样。构建了夏滞育和非滞育诱导敏感期六个cDNA测序文库,序列重组装后获得59,389 unigene,平均长度为1392bp。这些Unigene与各个蛋白质数据库进行比对,共16,641 unigene划分到65个GO功能组中。GO功能分组中,生物过程组占优势的是cellular processes和single-organism processes。在细胞成分的21个组分中绝大部分属cell and cell part。在分子功能组中,大部分基因属于结合和催化活性基因。2)基于GO注释,差异表达基因被归属到不同的通路中。与脂肪、碳水化合物、能量代谢、环境适应性、免疫反应和老化相关的功能组在夏滞育诱导阶段得到显著富集。一些unigene与脂肪代谢、压力反应、氧化压力保护、免疫反应和昼夜节律性有关。在这些基因中,热激蛋白在下调的基因中具有代表性,昼夜节律钟基因在昆虫滞育调控中有潜在的重要作用。3)与昼夜节律、寿命调控、氧化磷酸化、压力反应、TCA循环、脂肪酸代谢和MAPK信号通路相关的基因在非滞育敏感期差异表达。表明早在滞育诱导阶段已经发生了脂肪、碳水化合物和能量累积的代谢转变,这些代谢通路在葱蝇生长发育和滞育诱导中发挥了重要作用。而参与类固醇合成、脂肪酸代谢、柠檬酸循环、氧化磷酸化和压力反应的基因呈现显著的昼夜节律性表达模式表明昼夜生物钟参与了葱蝇滞育诱导。随后,对具有代表性的显著差异表达的10个基因进行了荧光定量PCR验证,证明了转录组和表达谱测序分析的可靠性。4)Hsp23和钟基因period,timeless,casein kinase1,shaggy,takeout昼夜及滞育诱导相关表达模式分析。热激蛋白在滞育诱导期和滞育期差异化表达模式可能与幼虫及滞育蛹响应热损伤有关,而钟基因在非滞育与夏滞育诱导敏感期幼虫之间不同的表达模式提示钟基因和葱蝇夏滞育诱导之间潜在的联系。5)利用PPI网络分析和iRefIndex数据库来鉴定共表达基因网络和与其它基因有密切关联的基因,基因网络分析中的核心基因deltex,hsp23,hsp60,hsp83,Jra,COX2,period,mastermind以及shaggy作为网络中的核心基因可能充当了葱蝇夏滞育诱导的核心调控成分。6)通过RT-qPCR对非滞育和夏滞育诱导最敏感时期的六个时间点的基因表达模式进行了分析。目标基因timeless,period,Casein kinase1,takeout,shaggy表现为振荡表达模式。timeless,ck1,period表现为滞育诱导相关显著上调表达,shaggy表现为滞育诱导相关下调表达,而takeout在S2vs.N2中显著下调,在S10vs.N10和S18vs.N18中均显著上调。与非滞育诱导相比,Hsp23在夏滞育诱导高温条件下呈现显著下调表达,进入蛹滞育后随即上调表达,表明热激蛋白在滞育诱导期和滞育期差异化表达模式可能与幼虫及滞育蛹响应热损伤有关。综上,葱蝇的滞育诱导是其个体发育过程中重要的上游生理-生态阶段,是一个纷繁复杂的动态的生理过程,有多个分子通路和多种基因的参与,受极为复杂的激素和环境调节机制所调控。本研究构建了首个葱蝇幼虫滞育诱导敏感期转录组及表达谱数据库,鉴定了葱蝇中可能与滞育诱导相关的基因,丰富了昆虫滞育调控的研究,为认知昆虫滞育及其调控的分子机理奠定了基础。