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[背景]溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种病因不清,难以治愈的慢性复发性结肠炎症性疾病,主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液血便等,因其病程冗长,反复发作且无法彻底治愈,严重影响患者的身心健康,并给家庭及社会带来较大负担。近年来,UC的发病率在世界范围内呈快速增长趋势。本课题组前期研究发现,热休克转录因子2(Heat shock transcription factors 2,HSF2)在UC患者中高表达,并与疾病严重程度呈正相关,在细胞实验中发现HSF2可上调细胞紧密连接蛋白Occludin,提示其可能参与调控UC黏膜屏障功能。目前,HSF2在UC发病机制中的作用尚未明确,且尚无关于HSF2在UC中与黏膜屏障功能关系的研究。本实验拟首先建立Hsf2基因敲除小鼠,然后研究Hsf2基因缺失对葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate,DSS)诱导的小鼠肠道炎症及黏膜屏障功能的影响,进一步揭示其在UC发生发展中的作用。[目的]首先通过CRISPR/Cas9技术建立Hsf2基因敲除纯合子转基因小鼠。其次,利用DSS诱导小鼠形成结肠炎模型,观察小鼠疾病活动指数(Disease activity index,DAI)、肠道损伤情况、肠道缩短程度、脾脏体积变化等,综合评估Hsf2对DSS小鼠结肠炎模型炎症反应的影响。最后,检测小鼠结肠组织内黏膜屏障相关蛋白:紧密连接蛋白Occludin、Zonalu Occluden-1(ZO-1)的基因转录水平及蛋白表达水平,从动物水平层面探讨Hsf2对肠黏膜屏障功能的影响。[方法]本研究分为两部分第一部分:Hsf2基因敲除小鼠的建系第二部分:Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道炎症及肠黏膜屏障功能的作用机制研究第一部分:Hsf2基因敲除小鼠的建系1、Hsf2基因敲除小鼠的建立:运用CRISPR/Cas9技术及显微注射方法,基本步骤包括:1)根据目标基因,在体外设计构建单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)和Cas9 mRNA;2)将sgRNA和Cas9 mRNA通过显微注射方法注射到受精卵雄性原核;3)将胚胎转移至假妊娠雌鼠输卵管中继续发育至分娩,得到Hsf2基因敲除的杂合子小鼠,采用PCR及测序方法对小鼠进行鉴定筛选,培育出F0代Hsp基因敲除杂合子小鼠。该实验引入通过此技术构建的Hsf2+/-小鼠F0代杂合子小鼠4只,进行保种及繁育。2、繁育及Hsf2基因敲除纯合子小鼠建系:选择周龄为7-8周的SPF级别C57BL/6基因敲除(Knock out,KO)小鼠及野生型(Wild type,WT)小鼠进行配种,合笼比例雄:雌为1:2或1:3,合笼至检查到雌性小鼠阴道出现阴道栓,提出雄鼠,单独饲养雌性小鼠至生育,采用PCR技术鉴定出Hsf2-/-小鼠,再用RT-PCR、Western Blot检测Hsf2基因转录水平及蛋白表达水平,验证敲除效果,建立纯合子Hsf2基因敲除小鼠。第二部分:Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道炎症及肠黏膜屏障功能的作用机制研究1、分组:选取健康SPF级C57BL/6小鼠进行实验。按照Hsf2基因是否敲除,将小鼠分为野生型组(WT组,16只)及基因敲除组(KO组,16只),采用RT-PCR及Western Blot技术验证敲除效果,予DSS诱导小鼠结肠炎造模,将上述两组分别组内随机分组为WT对照组(WT+H2O组,8只)、WT造模组(WT+DSS组,8只),KO对照组(KO+H2O组,8只)、KO造模组(KO+DSS组,8只)。2、DSS诱导结肠炎模型:造模组于实验第一天早上8点开始饮用含有2.5%DSS溶液的蒸馏水,对照组同时自由饮用蒸馏水,均连续饮用7天,第8日上午乙醚麻醉后予颈椎脱臼法处死小鼠,手术取小鼠结肠标本。3、Hsf2对DSS小鼠肠道炎症的作用:实验期间每天记录各组小鼠体重、大便潜血、进食、精神、活动、毛发光泽情况,根据体重变化、大便情况和便血情况评估疾病活动指数(Disease activity index,DAI),观察结肠组织大体标本,测量结肠长度和重量,脾脏长度及重量,结肠组织HE染色后进行病理学评分,综合评估肠道炎症程度。4、Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道黏膜屏障功能机制探索:RT-RCR及免疫组织化学检测结肠组织黏膜屏障相关蛋白中的紧密连接蛋白Occludin、Zonalu Occluden-1(ZO-1)的基因转录及蛋白表达水平。[结果]第一部分:Hsf2基因敲除小鼠的建系1、成功建立Hsf2基因敲除纯合子小鼠。采用RT-PCR、Western Blot对鉴定为Hsf2-/-小鼠验证其敲除效果,结果提示:KO组小鼠Hsf2基因转录水平及蛋白表达水平较WT组小鼠均明显降低,成功建立Hsf2基因敲除纯合子小鼠。2、Hsf2-/-小鼠生长正常,体重与同龄KO小鼠相近,成活率高,无畸形,且能正常受孕、正常繁殖后代。第二部分:Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道炎症及肠黏膜屏障功能作用机制的研究1、DSS成功诱导小鼠结肠炎模型。对比各组,KO+DSS组炎症反应最剧烈,小鼠血便最明显,体重降低最多,DAI评分、结肠大体评分最高,结肠缩短程度最明显,脾脏增大最明显;HE染色提示KO+DSS组小鼠结肠组织炎症反应最剧烈,结构破坏最显著,病理评分最高。各组间差异具有统计学意义。2、DSS造模后,紧密连接蛋白Occludin、ZO-1基因转录水平及蛋白表达水平降低。比较各组结肠组织紧密连接蛋白Occludin、ZO-1基因转录水平及免疫组化蛋白表达,结果提示,与对照组相比,模型组Occludin和ZO-1基因转录水平、蛋白表达水平明显降低,以KO+DSS组最为明显。各组间差异具有统计学意义。[结论]1、运用CRISPR/Cas9技术及显微注射方法,获得稳定的Hsf2-/-小鼠,Hsf2基因敲除后不影响小鼠成活率,无畸形发生,且能正常生长,可能会对繁殖有影响,成活小鼠能耐受DSS,成功构建Hsf2基因敲除小鼠。2、2.5%DSS可成功诱导小鼠实验性结肠炎模型。2.5%DSS诱导造模后,小鼠出现体重下降、便血等症状,造模期间无小鼠死亡,均能耐受该浓度DSS;处死后获取小鼠结肠组织,DSS造模组炎症更明显。3、Hsf2基因敲除后,小鼠对DSS诱导的结肠炎更敏感。低水平Hsf2小鼠经DSS诱导结肠炎症后,小鼠DAI评分明显升高,结肠组织炎症反应更加明显。4、Hsf2基因敲除后,小鼠肠上皮紧密连接蛋白Occludin和ZO-1基因转录水平及蛋白表达下降,提示Hsf2可能参与调控小鼠肠黏膜屏障功能。