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研究目的:骨骼肌损伤是最常见,最棘手的运动损伤之一。骨骼肌损伤后巨噬细胞在其修复过程中发挥重要作用。但目前对骨骼肌损伤后巨噬细胞发挥作用的机制并不明了。因此,我们建立小鼠骨骼肌钝挫伤模型和巨噬细胞剔除模型,观察巨噬细胞剔除后骨骼肌损伤修复过程中肌卫星细胞增殖分化、炎症因子、肌再生调节因子、趋化因子、血管再生因子、氧化应激因子表达规律及Akt/mTOR信号通路激活状况,以深入探究巨噬细胞在骨骼肌损伤修复中的作用及其机制。研究方法:80只雄性C57BL/6小鼠随机分为骨骼肌损伤组(S,n=32),未损伤对照组(SConn,n=8),损伤+巨噬细胞剔除组(T,n=32),未损伤+巨噬细胞剔除对照组(TCon,n=8)。骨骼肌钝挫伤后1d,3d,7d和14d取双侧腓肠肌。流式细胞术检测巨噬细胞剔除效果,HE染色观察骨骼肌形态学变化,荧光定量PCR及western blotting检测炎症因子、肌再生因子、趋化因子、血管再生因子、氧化应激因子、及Akt/mTOR蛋白质合成信号分子表达变化。研究结果:1.巨噬细胞剔除损害骨骼肌再生HE染色结果显示,骨骼肌钝挫伤后肌纤维结构破坏、大量肌纤维坏死、肿胀(损伤第1d,3d),损伤第7d出现大量再生肌纤维,而剔除组在伤后第7d仅出现少量再生肌纤维。伤后第14d巨噬细胞剔除组仍有大量再生肌纤维出现,提示巨噬细胞剔除损害骨骼肌再生。2.巨噬细胞剔除对肌卫星细胞增殖分化的影响荧光定量PCR结果显示,骨骼肌损伤后第1d和3d肌卫星细胞增殖标志物MyoD和分化标志物myogenin表达均显著高于对照组(p<0.01)。而与损伤组相比,巨噬细胞剔除显著抑制了 MyoD在伤后第7d的表达(p<0.05),促进myogenin在伤后第14d的表达(p<0.05)。3.巨噬细胞剔除对肌再生因子表达的影响损伤组HGF mRNA在伤后第1d,3d和7d表达量均显著增加(p<0.01),巨噬细胞剔除组HGF在伤后第1d和3d表达量显著低于损伤组(p<0.05)。uPA和IGF-1mRNA的表达与HGF相似,在损伤后表达量显著增加,巨噬细胞剔除后表达显著降低。MGF在伤后表达无显著变化,但巨噬细胞剔除显著下调其在伤后第1d和7d的表达。损伤组GDF11 mRNA在伤后第1d表达显著增加,巨噬细胞剔除组GDF11亦在伤后第1d表达显著增加,且与损伤组相比在伤后第7d的表达显著降低(p<0.05)。损伤组CB2R mRNA在伤后1d和3d表达显著增加(p<0.01),而与损伤组相比巨噬细胞剔除显著抑制其在伤后1d和7d的表达。4.巨噬细胞剔除对损伤骨骼肌炎症因子表达的影响促炎细胞因子TNF-α mRNA在伤后第1d,3d,7d和14d表达显著增加(p<0.01)。与损伤组相比,巨噬细胞剔除显著提高TNF-αmRNA在伤后第7d的表达(p<0.01),抑制其在伤后1d的表达(p<0.05)。IFN-γ和IL-6mRNA的表达与TNF-α表达相似,在伤后表达显著增加,巨噬细胞剔除显著促进其在伤后第14d表达(p<0.05)。损伤组IL-12mRNA在伤后1d和3d表达显著增加(p<0.01),巨噬细胞剔除组仅在伤后3d表达显著增加(p<0.01)。而与损伤组相比,巨噬细胞剔除组中IL-12 mRNA表达并无显著变化。损伤组TWEAK mRNA在伤后3d和7d表达均显著增加,剔除组TWEAK mRNA在伤后1d和7d表达显著下降,且剔除组TWEAK mRNA在伤后1d和7d表达显著低于损伤组,而在损伤前及伤后第14d表达均显著高于损伤组。抑炎细胞因子IL-10 mRNA在伤后1-7d表达量显著增加(p<0.01),而巨噬细胞剔除显著下调其在伤后第1d的表达(p<0.05)。5.巨噬细胞剔除对损伤骨骼肌趋化因子表达的影响RT-PCR结果显示,损伤组中骨骼肌趋化因子(CCL2,CCL3,CCL8,CXCR4)mRNA在伤后1-7d表达均显著增加,而CCL4mRNA在伤后第14d表达显著降低(p<0.01),CXCL12仅在伤后第7d表达显著增加(p<0.01)。与损伤组相比,巨噬细胞剔除显著提高CCL2在伤后第14d表达(p<0.05),显著提高CCL3在伤后3d和14d的表达(p<0.05),下调CCL4在伤后第1d表达(p<0.01),提高CCL4在伤后第14d表达(p<0.01),下调CCL8在伤后1d和3d表达(p<0.01),提高伤后第14d表达(p<0.01),上调CXCL12和CXCR4在伤后14d表达(p<0.01)。6.巨噬细胞剔除对损伤骨骼肌氧化应激因子表达的影响RT-PCR结果显示,gp91phox mRNA在伤后1d,3d和7d表达均显著增加,剔除组gp91phox mRNA在伤后7d和14d表达均显著增加(p<0.01),且与损伤组相比在伤后第1d,3d和7d表达显著下降,伤后14d表达显著增加(p<0.05)。损伤组gp91phox蛋白在伤后第3d表达显著增加(p<0.01)。巨噬细胞剔除组gP91phox蛋白表达与剔除对照组相比并无显著差异。但在伤后第14d,剔除组gp91phox蛋白表达显著高于损伤组(p<0.01)。7.巨噬细胞剔除对损伤骨骼肌血管再生因子表达的影响损伤组HIF-1α mRNA在伤后1d,3d和7d表达均显著增加,剔除组损伤前及伤后第14d HIF-1α mRNA表达显著高于损伤组。损伤组Angpt1在伤后1d,3d,7d,14d表达均显著增加(p<0.01)。剔除组Angpt1 伤后1-14d表达均显著增加(p<0.01),且在损伤前以及损伤后第14d表达均显著高于损伤组(p<0.05)。损伤组VEGF在伤后第7d表达显著低于对照组(p<0.05),剔除组VEGFmRNA在伤后1-14d表达均显著降低(p<0.01),而剔除对照组VEGF mRNA显著高于损伤对照组(p<0.05)。8.巨噬细胞剔除对损伤骨骼肌蛋白质合成信号分子表达的影响Western Blotting结果显示,损伤组骨骼肌p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR均在伤后第1d表达显著增加(p<0.05),p-p70s6k/p70s6k在伤后1d和3d表达均显著增加,P-4EBP1/4EBP1在伤后1d,3d,7d和14d表达均显著增加。而巨噬细胞剔除组 p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR,p-p70s6k/p70s6k 和 P-4EBP1/4EBP1 与对照组及损伤组相比虽有增加,但并无显著变化(p>0.05)。研究结论:1.骨骼肌损伤修复过程中肌卫星细胞增殖分化标志物、巨噬细胞、炎症因子、肌再生因子、趋化因子、血管再生因子、氧化应激因子以及蛋白质合成信号分子表达均出现显著变化,提示其可能在骨骼肌损伤修复过程中发挥重要作用。2.巨噬细胞剔除可损害骨骼肌损伤再生,其机制可能与下调肌再生因子表达、上调损伤后期炎症因子、趋化因子、氧化应激水平,抑制血管再生以及Akt/mTOR蛋白质合成信号通路的激活有关,巨噬细胞在损伤骨骼肌修复过程中发挥了重要作用。