在整个生物体能量平衡中肝脏代谢调控系统起着关键作用,因为肝脏是糖代谢(糖酵解和肝糖原合成)和甘油三脂合成(脂肪生成)的主要部位。脂肪生成会受到关键酶的调控,这些酶的活性依靠变构和共价修饰产生。大部分糖酵解和脂肪生成过程中的酶的合成会受到进食状况的调控,其中葡萄糖是起到至关重要作用的营养物质。葡萄糖主要作用于编码这些酶的基因的转录调控过程。糖应答元件结合蛋白(ChREBP)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCs)是糖／脂代谢过程中两个重要因子。ChREBP是碱性／环-螺旋-环／亮氨酸拉链(bHLH/LZ)转录因子家族成员,在肝脏内大量表达的。它在进食高碳水化合物食物后会高效表达,而在进食高脂类食物后其表达会受到抑制。它对很多脂酶有调控作用。同时,ChREBP的活性又会被胰岛素、葡萄糖和抗糖尿病类药物的调节。因此,研究ChREBP的作用机理有着重要的意义。ACCs家族目前发现的有两个成员：ACC1和ACC2。ACC1主要是在肝脏和脂肪组织的细胞质中表达；ACC2主要是在心脏和肌肉组织的线粒体中表达。ACCs是ChREBP的靶基因之一,会受到食物、激素和其他一些生理因子的调控。本研究采用real-time PCR和细胞转染等技术,对猪ChREBP基因的生物学特性,ChREBP的功能和转录水平的表达调控,ACC1转录水平的表达调控等进行了研究,获得如下结果：1.通过同源分析比较,以小鼠和人的ChREBP基因序列为参照,运用RT-PCR方法,获得了猪ChREBP基因；以猪的心、肝、脾、和肺等11个组织样品作为研究材料,通过半定量RT-PCR分析获得了ChREBP的组织表达谱；通过辐射杂种板分析进行了ChREBP的染色体定位,并与人的定位结果进行了比较。2.在无血清无糖培养条件下,对HepG2人肝癌细胞系进行葡萄糖和胰岛素的时间和梯度刺激。采用real-time PCR方法,检测了ChREBP、胆固醇应答元件结合蛋白(SREBP-1c).ACC1和脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表达量。结果表明,葡萄糖在单独作用时也可引起ChREBP.SREBP-1c.ACC1和FAS表达量的升高。3.以RT-PCR的方式,克隆得到ChREBP和SREBP-1c的编码序列,分别构建真核表达载体。通过转染和共转染,研究ChREBP和SREBP-1c对靶基因(ACC1)的调控作用。结果表明,ChREBP和SREBP-1c并无协同作用,相反它们有可能对靶基因启动子区的调控位点有竞争作用。4.在游离脂肪酸的作用下,细胞中ChREBP和SREBP-1c mRNA的表达量下降,而ACC1的表达量却在花生四稀酸存在的情况下大幅度升高。相关因子肝脏X蛋白受体(LXR)和过氧化酶增值体激活受体(PPARa)在花生四稀酸的作用下表达量无明显变化,但cAMP应答元件结合蛋白1 (CREB1)的表达量有所增高。这表明,花生四稀酸不是通过已知两条糖／脂代谢途径来诱导ACC1表达的。5.检测花生四稀酸诱导或转染CREB1后的细胞培养液中的葡萄糖含量和细胞中甘油三酯的含量,同时通过real-time PCR,检测了细胞中葡萄糖吸收和脂肪酸合成的标志性基因——葡萄糖转运蛋白2 (GLUT2),葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和FAS的表达量。综合以上结果,表明花生四稀酸对ACC1的诱导会引起细胞中甘油三酯的沉积,但对葡萄糖的摄取没有明显影响。6.构建CREB1的真核表达载体及ACC1的启动子荧光素酶载体,进行转染和共转染。通过real-time PCR检测转染CREB1的细胞中ChREBP, SREBP-1c和ACC1的表达量。在共转染后,检测荧光素酶的活性,观察ACC1启动子活性的变化。结果表明,CREB1可结合到ACC1的PⅡ启动子上。这与花生四稀酸的诱导实验的结果相同,进一步证实花生四稀酸是通过CREB1来调控ACC1的表达的。这一作用可能与前列腺素(PG)途径相关。