背景与目的:肺癌是我国高发恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)占85%以上。尽管手术、放化疗等治疗手段不断在进步,NSCLC患者5年生存率仍徘徊在15%左右。近年来,以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)为代表的分子靶向治疗药物被广泛应用于临床一线晚期NSCLC的患者,以其针对性强,不良反应小,疗效肯定等优点备受关注。然而,应用EGFR-TKIs治疗的患者经过8~12个月的有效治疗时间后,都无法逃脱对EGFR-TKIs继发耐药的恶梦。因此,寻找EGFR-TKIs继发耐药的原因,探讨其耐药机制已经成为已成为NSCLC临床治疗的研究热点。众所周知,mi RNAs是一种极为重要的基因调控物质,它调控着大约30%的人类基因的转录过程。近年来研究发现miRNAs在耐药调控中也起到了重要的作用。包括本课题组前期工作在内的大量研究证实:miRNA223能够通过调控胰岛素样生长因子1受体/磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B信号通路(IGF-1R/P13K/Akt)而调控细胞的多种功能,并且IGF-1R/P13K/Akt信号通路的异常活化可能是肺癌细胞对EGFR-TKIs分子靶向治疗发生耐药的机制之一。本研究中,我们首先诱导培养EGFR-TKIs敏感细胞株PC9细胞和HCC827细胞对EGFR-TKIs代表药物厄洛替尼(Erlotinib)产生持续耐药,探讨持续耐药细胞与亲代细胞中miR-223的表达差异,检测细胞中IGF-1R、p-IGF-1R、Akt和p-Akt等重要分子的变化,发现在PC9持续耐药细胞中miR-223表达较亲代细胞中表达下调,并负向调控其靶分子IGF-1R从而激活下游PI3K/Akt通路,这一结果在体内实验中也得到了验证。同时,我们在实验过程中发现了一个很有趣的现象:即在PC9细胞中检测到约3.05%的CD133阳性细胞的存在;而在PC9Erlotinib持续耐药细胞中CD133阳性细胞明显增高,是PC9细胞中的4.96倍。为了探讨干细胞样细胞与EGFR-TKIs继发耐药之间的关系及其机制,我们在PC9细胞中分离培养了干细胞样细胞PC9/CD133+细胞,并对PC9/CD133+细胞及其亲代细胞PC9细胞中miR-223的表达进行了检测,也同步检测了细胞中IGF-1R、p-IGF-1R、akt、pakt等重要分子的变化,发现在pc9持续耐药细胞中mir-223表达较亲代细胞中表达下调,并负向调控其靶分子igf-1r从而激活下游pi3k/akt通路。在两种细胞中过表达mir-223后igf-1r/pi3k/akt通路均受到抑制,细胞的耐药性也会被部分逆转。综上所述,我们的实验结果显示在erlotinib持续耐药细胞和干细胞样细胞(pc9/cd133+细胞)中mir-223下调导致igf-1r/pi3k/akt旁路活化可能是egfr-tkis继发耐药机制之一,为egfr-tkis继发耐药的机制探讨提供了新的思路。材料和方法:1.erlotinib持续耐药状态细胞pc9/er、hcc827/er的建立和耐药性的检测:培养人nsclc细胞株pc9及hcc827细胞,大剂量冲击法(1-5μmerlotinib)联合小剂量(0.01μmerlotinib)维持法建立erlotinib持续耐药状态细胞pc9/er及hcc827/er细胞;arms-pcr法对pc9/er及hcc827/er细胞进行了egfr外显子18、19、20、21、t790m、s768i的基因检测;cck8法检测erlotinib对pc9、pc9/er细胞及hcc827、hcc827/er细胞的抑制率ic50;real-timert-pcr检测pc9、pc9/er及hcc827、hcc827er两组细胞中mir-223和pten(geneofphosphateandtensionhomologydeletedonchromsometen)、c-met(cellular-mesenchymaltoepithelialtransitionfactor)mrna的表达;western-blot检测pten、akt(serine-threonineproteinkinase)、p-akt(phosphorylatedserine-threonineproteinkinase)蛋白的表达。2.nsclc干细胞样细胞pc9/cd133+的分离、培养与鉴定:使用无血清培养基体外连续悬浮培养,联合化疗药物紫杉醇(0.1μmol/l)逆向诱导的方法得到成球细胞克隆,经流式细胞仪分选出cd133阳性细胞命名为pc9/cd133+细胞;流式细胞仪检测第四代紫杉醇逆向诱导处理后细胞的cd133阳性率;cck8法检测erlotinib对pc9和pc9/cd133+细胞的抑制率ic50;裸鼠体内成瘤实验检测干细胞样细胞pc9/cd133+细胞的体内成瘤能力:将生长状态良好的6~8周龄雄性裸鼠9只,随机分成三个组,每组3只;pc9/cd133+细胞组(接种细胞数5×104个);pc9细胞组(接种细胞数5×104个)和pc9细胞组(接种细胞数5×106个),注射部位在裸鼠的左前肢近头侧皮下,观察成瘤3周后处死裸鼠,取出瘤组织进行病理学检测。3.体外实验验证mir-223调控igf-1r/pi3k/akt旁路活化在nsclcpc9细胞erlotinib耐药中的作用:培养人nsclc细胞株pc9、pc9/er及pc9/cd133+细胞;慢病毒感染的方法上调mir-223在pc9/er及pc9/cd133+细胞中的表达并设感染对照(转染mir-223的细胞命名为:pc9/er-mir-223、pc9/cd133+-mir-223细胞;转染空质粒对照命名为:pc9/er-ev、pc9/cd133+-ev细胞);cck8法检测erlotinib对pc9、pc9/er、pc9/er-mir-223、pc9/er-ev细胞抑制率;real-timert-pcr检测pc9/er感染mir-223后igf-1rmrna的变化;pc9、pc9/er用浓度为0、0.001和0.01μm的erlotinib干预72h后,提取蛋白,western-blot检测egfr、p-egfr、igf-1r、p-igf-1r、akt、p-akt、p70s6k和p-p70s6k等蛋白的表达;western-blot检测pc9、pc9/er、pc9/er-mir-223、pc9/er-ev细胞中igf-1r、p-igf-1r、akt、p-akt、p70s6k和p-p70s6k等蛋白的表达情况;用igf-1r激动剂igf-1(10ng/ml)干预15min后(命名为:pc9/er-mir-223-igf-1细胞)检测pc9/er、pc9/er-mir-223和pc9/er-mir-223-igf1细胞中igf-1r、p-igf-1r、akt、p-akt、p70s6k和p-p70s6k等蛋白的表达情况。cck8法检测erlotinib对pc9、pc9/cd133+、pc9/cd133+-mir-223及pc9/cd133+-ev细胞的抑制率ic50值;western-blot检测pc9、pc9/cd133+、pc9/cd133+-mir-223及pc9/cd133+-ev细胞中igf-1r、p-igf-1r、akt及p-akt等蛋白的表达情况。4.体内实验验证mir-223调控igf-1r/pi3k/akt旁路活化在nsclcpc9细胞erlotinib耐药中的作用:培养pc9、pc9/er、pc9/er-mir-223、pc9/er-ev细胞;购买6~8周龄雄性裸鼠,随机分成4组(pc9、pc9/er、pc9/er-mir-223、pc9/er-ev组),每组5只,分别于每只裸鼠的右上肢腋窝近颈部处注射5×106个肿瘤细胞,每3天观察成瘤及裸鼠状态一次,1周后各组均成瘤,2周后待瘤体平均约100mm3时,给予erlotinib30mg/kg/d的剂量灌喂裸鼠,药物干预两周后将动物处死,取出肿瘤组织备检。real-timert-pcr检测pc9、pc9/er、pc9/er-mir-223、pc9/er-ev各组mir-223、igf-1rmrna的表达;western-blot检测各组igf-1r、p-igf-1r、akt、p-akt、p70s6k和p-p70s6k等蛋白的表达情况。结果:1.历时8个月,成功建立了人nsclcerlotinib持续耐药状态细胞pc9/er和hcc827/er细胞。pc9/er和hcc827/er细胞的耐药指数ic50分别为734.84±69.02nm和3103±601.16nm,分别是亲代细胞的37.4和155.4倍。耐药细胞与亲代细胞相比,在形态上有差异,耐药细胞体积略小,多数呈长梭形改变。egfr基因突变检测,两株耐药细胞都未发生常见的t790m突变,并且都未检测出c-met基因的扩增,但两株耐药细胞还是显示了不同的特点:在hcc827/er细胞中,检测到了pten基因下调,较亲代细胞降低了50%,而且pten蛋白较亲代细胞也明显降低,其下游p-akt蛋白活化。这一现象在pc9/er中并未发现;在pc9/er中,mir-223的表达较亲代细胞下降了88%,而在hcc827/er细胞中并未降低。2.流式细胞学检测第四代紫杉醇逆向诱导的pc9细胞,cd133阳性率为91.74%,细胞能够在干细胞培养基中连续成球生长。erlotinib对pc9/cd133+细胞抑制率ic50值为653.73±15.45nm,耐药指数是pc9细胞的33.28倍。裸鼠体内成瘤结果显示:pc9/cd133+(接种细胞数5×104个)细胞组和pc9细胞组(接种细胞数5×106个)能够成功致瘤;pc9细胞组(接种细胞数5×104个)未能成瘤,pc9/cd133+细胞在裸鼠体内成瘤只需104细胞数量级即可,而pc9细胞裸鼠体内成功致瘤则需106细胞数量级。干细胞样细胞(pc9/cd133+细胞)成瘤组织与pc9细胞成瘤组织病理切片he染色后,镜下观察均提示典型的腺癌样病理改变。3.pc9/er细胞较亲代细胞中mir-223表达降低了88%(p<0.05),而igf-1rmrna表达上调;高表达mir-223后,pc9/er-223细胞igf-1rmrna表达较pc9/er细胞降低了50%,并且p-igf-1r、p-akt及p-70s6k蛋白表达也明显降低,这一结果说明igf-1r被mir-223抑制后,其下游的信号通路pi3k/akt/mtor/p70s6k也受到了明显的抑制。igf-1r激动剂igf-1(10ng/ml)干预pc9/er-mir-223细胞15min,模拟mir-223表达下调导致igf-1r上调后igf-1r/pi3k/akt通路的变化,pc9/er-mir-223-igf-1细胞中igf-1r、p-igf-1r及p-akt蛋白较pc9/er-mir-223中表达增高,igf-1r激动剂可以部分逆转高表达mir-223对igf-1r/pi3k/akt通路的抑制作用。干细胞样细胞pc9/cd133+细胞较pc9细胞mir-223的表达降低了72.6%,高表达mir-223后,p-igf-1r及p-akt蛋白表达也明显降低,说明igf-1r被mir-223抑制后,其下游的信号通路pi3k/akt也受到了明显的抑制。以上结果表明,pc9/er细胞和干细胞样细胞pc9/cd133+细胞中mir-223表达下调导致igf-1r/pi3k/akt通路活化是细胞发生耐药的机制。4.我们成功将感染高表达mir-223及对照病毒的细胞在裸鼠体内成瘤,并用激光共聚焦成像技术进行确认转染质粒在动物体内稳定存在;利用real-timepcr方法检测移植瘤组织中mir-223的表达,进一步确定感染lv-has-mir-223-3p在动物体内稳定表达。我们发现在动物体内高表达mir-223后igf-lrmrna和igf-lr蛋白水平都受到了抑制,其下游的p-akt、p-p70s6k6蛋白也明显受到抑制,提示高表达mir-223后igf-lr/pi3k/akt/mtor/p70s6k信号通路受到抑制,体内实验与细胞水平实验结果一致。结论:1.我们通过对EGFR-TKIs敏感细胞株PC9细胞及HCC827细胞给予Erlotinib大剂量冲击联合小剂量维持的方法成功自建了Erlotinib持续耐药状态细胞PC9/ER细胞和HCC827/ER细胞。并发现,在相同条件下建立的持续耐药状态细胞,发生继发耐药的机制可能会不尽相同,提示体内应用EGFR-TKIs发生继发耐药机制研究的复杂性。2.发现PC9/ER细胞中miR-223的表达较PC9细胞中明显降低,miR-223在PC9/ER细胞表达下调导致其负向调控的靶基因IGF-1R表达增高,继而导致PI3K/Akt信号通路激活也会被激活,因此,我们推测IGF-1R/PI3K/Akt信号通路的激活可能是PC9/ER细胞发生继发耐药的机制之一;高表达miR-223后不但可以抑制IGF-1R/PI3K/Akt通路过度活化,还可以抑制其下游mTOR/p70S6K信号通路,故mi R-223可能还参与了肿瘤细胞增殖方面的调控,需要进一步实验去验证。利用裸鼠成瘤实验对上述细胞水平的实验进行了体内实验的验证,体内、体外实验得到了一致的结论。3.miR-223在干细胞样细胞PC9/CD133+细胞中表达下调导致其负向调控的靶基因IGF-1R表达增高,继而导致PI3K/Akt信号通路被激活,高表达miR-223可以抑制IGF-1R/PI3K/Akt通路过度活化,因此,我们推测IGF-1R/PI3K/Akt信号通路的激活可能也是干细胞样细胞PC9/CD133+发生Erlotinib耐药的分子机制,Erlotinib不能有效的抑制PC9细胞中的干细胞,可能是其发生继发耐药的机制之一。