放射性肺损伤（Radiation Pulmonary leision, RPL）是胸部肿瘤放射治疗和骨髓移植全身照射预处理的常见严重并发症和剂量限制因素，RPL属于非感染性炎症，一旦发生往往不可逆转[1]，其发病机制至今尚不清楚，缺乏有效的预测指标和治疗手段，成为胸部肿瘤得到有效治疗的难题。细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）是一重要的细胞间粘附分子和炎症介质，国际编号CD54，它参与细胞的信号传导与活化，细胞的伸展、移动、生长、分化，炎症、血栓的形成，肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要的生理和病理过程[2]。ICAM-1在RPL中通过介导多形核嗜中性粒细胞（polymorphonuclear, PMN）等白细胞粘附、聚集于肺泡区域，是导致肺实质细胞损伤及持续细胞因子释放的关键因素，有报道表明抗ICAM-1抗体可以降低肺损伤的程度[3-4]，但目前关于ICAM-1在RPL中的具体作用机制及是否可以作为减轻放射性肺损伤的新靶点尚待进一步研究。本文利用RNA干扰技术建立ICAM-1基因沉默细胞株以及应用基因芯片技术具体从细胞与基因水平上分析其在RPL中的作用途径及方式，为寻找防治RPL的有效措施提供理论依据和新思路。【目的】1.采用60Co γ射线照射建立小鼠放射性肺损伤模型，探讨ICAM-1及相关因子在RPL中的表达变化。2.构建ICAM-1基因沉默的小鼠肺腺癌细胞株（Lewis lung cell,LLC），探讨ICAM-1基因沉默前后LLC细胞的生物学特性及基因表达谱的变化。3.探讨ICAM-1基因沉默对LLC细胞辐射敏感性的影响。【方法】1.采用照射剂量为16Gy的60Co γ射线全肺单次照射建立小鼠放射性肺损伤模型，HE染色法观察小鼠肺组织损伤，免疫组化及Elisa法测定小鼠肺ICAM-1、转化生长因子-β1（TGFβ1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达变化。2.①针对ICAM-1mRNA序列，筛选、设计并合成shRNA相关基因片段，构建3条高特异性的shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA，采用酶切及DNA测序法验证插入序列的正确性。②脂质体法质粒转染LLC细胞，遗传霉素G418抗性筛选获得阳性克隆。RT-PCR和Western blot法检测shRNA对ICAM-1基因的沉默效率。③应用倒置显微镜观察ICAM-1基因沉默前后细胞形态变化，绘制生长曲线分析细胞生长分裂差异，采用MTT比色分析法测定其增殖活性，基因芯片技术分析LLC细胞中ICAM-1基因下调后全基因组表达谱的变化，筛选可能与ICAM-1信号通路有关的差异基因，寻找ICAM-1信号通路的传导过程以及其在肺癌细胞增殖、迁移调控中的可能分子机制。3.采用照射剂量为4Gy的60Co γ射线照射ICAM-1基因沉默LLC细胞株，MTT法检测辐照对其增殖活力的影响，集落形成率试验检测其对辐照敏感性的变化，流式细胞仪检测辐照对其细胞凋亡与周期的影响，探讨ICAM-1在辐照后的小鼠肺腺癌LLC细胞株中的作用机制。【结果】1.与对照组比较，照射组的小鼠至照射后随时间延长出现精神萎靡，反应迟钝，毛发有明显脱落现象，肺呈充血水肿、不均质；肺泡壁增厚，炎性细胞浸润明显；肺组织中ICAM-1及其相关蛋白TGF-β1表达量明显增加（P<0.01, P<0.05），TNF-α表达量有所增加，但与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。2.①经酶切和DNA测序鉴定，成功构建了3条靶向抑制小鼠ICAM-1基因及一条阴性对照的shRNA真核表达载体pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA。②成功筛选稳定抑制ICAM-1表达的永久性细胞克隆，RT-PCR及Western blot技术检测靶细胞在mRNA水平和蛋白水平上ICAM-1的抑制率分别为76.79%和79.01%(P<0.01)。③与对照组比较，ICAM-1基因沉默组细胞形态发生改变，细胞生长分裂周期延长；MTT结果显示沉默组细胞增殖活性降低；基因芯片结果提示在沉默组LLC-ICAM1细胞与对照组LLC-NC细胞间共有290个存在明显差异表达的基因，其中表达上调的基因有238个，下调的基因有52个。3.MTT及集落形成率试验结果表明ICAM-1基因沉默组对辐照的敏感度下降，在同等剂量的辐照条件下ICAM-1基因沉默组受到辐照后损伤程度降低，增殖活性及恢复能力均比对照组增强；流式凋亡结果显示ICAM-1基因沉默组细胞受到辐照后24h、48h细胞凋亡率均比对照组小，且48h后恢复情况也较对照组好，辐照24h后的细胞周期G2/M期比例明显增加，48h后比例有所下降但仍比未辐照组高，提示与细胞凋亡结果相一致。【结论】1.在16Gy60Coγ射线照射建立的小鼠放射性肺损伤模型中研究发现，肺组织中ICAM-1蛋白存在异常表达，且与TGF-β1、TNF-α的表达变化相一致。提示ICAM-1的表达水平的高低可能与放射性肺损伤具有一定的相关性，且与TGF-β1、TNF-α等细胞因子存在相互作用，可作为预测或评价放射性肺损伤程度的一个重要因子。2.靶向ICAM-1基因的重组质粒载体pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA构建成功，为建立ICAM-1基因沉默细胞株及后续研究奠定基础。3.成功构建ICAM-1基因沉默细胞株，沉默细胞株的生物特性研究提示ICAM-1可能参与细胞增殖等生理活动。4.利用基因芯片技术分析ICAM-1基因沉默后全基因组表达谱的变化，发现ICAM-1可能通过Bax/Bcl-2、FasL/Fas、MAPK等通路参与细胞增殖、凋亡等生理过程。5.在ICAM-1在照射后LLC细胞株中的作用机制研究试验结果中，发现干扰ICAM-1基因的表达，可以明显降低LLC细胞株的辐射敏感性，增强辐射损伤后的恢复力。提示ICAM-1在放射性肺损伤中可作为基因治疗潜在的分子靶点，为临床治疗提供新的有效的治疗策略。