生物传感方法具有操作简便、经济、高灵敏及强特异性等优点,广泛应用于疾病监测、食品分析和公共卫生安全等领域。分子识别元件和信号转换元件是生物传感系统的两个重要组成部分,它们分别决定着生物传感方法的特异性和灵敏度。近年来,随着生物技术领域的快速发展,诞生了一门新兴的交叉学科——合成生物学。合成生物学的宗旨是基于工程学理念和生物学技术设计出具有新功能的生物元件、网络和系统等。因此,合成生物学为生物传感领域提供大量分子识别元件和信号转换元件,极大促进了生物传感领域的快速发展。本文分别利用CRISPR-Cas12a和响应型RNA聚合酶等元件,构建了一系列生物传感新方法,应用于临床实际样品中病毒核酸、致癌基因突变和蛋白酶等生物标志物的高灵敏和高特异性检测。论文的主要研究内容如下:（1）探究CRISPR-Cas12a系统中核酸组分对Cas12a附属切割活性的影响。在CRISPR-Cas12a系统中,guide RNA（g RNA）引导Cas12a蛋白特异性识别并切割靶标双链DNA（ds DNA）,随后激活切割任意单链DNA（ss DNA）的附属切割活性。本章中,我们以Lb Cas12a蛋白为例,探究CRISPR-Cas12a系统中ds DNA、g RNA等核酸组件的组成和结构对其附属切割活性的影响。我们详细考查靶标ds DNA中Protospacer Adjacent Motif（PAM）序列、PAM上游序列以及Target Sequence（TS）序列的长度和组成等因素对Lb Cas12a附属切割活性的影响。此外,我们还设计了一系列inhibitor DNA（i DNA）,其通过核酸杂交影响g RNA的二级结构及活性,从而间接抑制Cas12a的附属切割活性。最后,我们还探究了Cas12a对双链中ss DNA凸起的附属切割行为,以及ss DNA凸起的大小和碱基组成对附属切割效率的影响。在以上研究结果的基础上,我们合理设计i DNA实现了对Cas12a附属切割活性调控,为后续设计基于Cas12a附属切割活性的生物传感新方法奠定了基础。（2）CRISPR-Cas12a自催化驱动的正反馈核酸回路的构建。人工核酸回路具有精确可控动态和功能等优点,在生物传感领域具有巨大的应用潜力。但是,在分子诊断中人工核酸回路面临着不能直接处理基因组DNA和检测灵敏度不足的挑战。针对该问题,我们在研究了Cas12a附属切割活性调控的基础上,发展了CRISPR-Cas自催化驱动的正反馈核酸回路（CRISPR-Cas-only amplification network,简称CONAN）,实现了基因组DNA的等温放大检测。在CONAN系统中,我们整合了Cas12a的精准靶标识别能力、解旋酶活性和高效附属切割活性,构建Cas12a自催化驱动的人工正反馈化学反应网络,仅使用CRISPR-Cas组件即实现了指数式的信号放大。在优化相关反应条件基础上,CONAN可特异性检测低至浓度为5.0 a M的人工合成靶标DNA。由于正反馈过程中的信号差异累积效应,CONAN显著提高了CRISPR-Cas12a系统对单核苷酸突变的敏感性,尤其是提高了对PAM远端错配的敏感性。综上,本节基于CRISPR-Cas12a系统构建了自催化驱动的正反馈核酸回路,实现了超灵敏、高特异性检测靶标DNA,为人工核酸回路在分子诊断领域的应用提供新策略。（3）CONAN系统在临床分子诊断中的应用。在本节中,我们探究了CONAN系统在临床分析诊断领域的应用潜能,将其应用于临床生物样本中基因组DNA的检测。实验结果表明,CONAN系统不仅可以检测低至5.0 a M的HBV感染细胞中的基因组DNA,而且可以应用于HBV感染者和未感染者临床血清样本的检测,得到检测结果与q RT-PCR方法相一致。此外,CONAN系统可以准确检测细胞样本中膀胱癌相关的PIK3CA基因突变体（1633G>A）,检测限低至10 a M。进一步实验结果表明,CONAN系统能够区分膀胱癌临床样本中不同突变频率的单核苷酸突变,其结果与高通量测序技术测量结果相一致,显示了良好的临床分子诊断应用前景。（4）基于响应型RNA聚合酶元件的电化学蛋白酶传感器。在本节中,我们将响应型RNA聚合酶（PR）元件与电化学检测界面相结合构建了一种高灵敏检测蛋白酶的电化学生物传感器。我们利用PR元件将靶标蛋白酶单次水解事件转化为多个可编程的RNA输出,并将其设计为可特异性结合铁卟啉的G四链体序列,从而实现免标记的电化学检测蛋白酶活性。以肿瘤标志物基质金属蛋白酶-2（MMP-2）为例,该电化学传感器对10 f M-1.0 n M浓度范围的MMP-2具有良好的线性响应,检测限低至7.1 f M。该传感器还可应用于不同细胞培养和人体骨肉瘤组织样本中的MMP-2活性的评估,显示了其在分析复杂临床样本中蛋白酶生物标志物的潜力。