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研究目的：
青光眼(Glaucoma)是一组以眼内压升高为主要表现的疾病,可导致不可逆性视神经损害,是世界范围内第二大致盲眼病。迄今为止,青光眼滤过性手术(Glaucomafiltration surgery,GFS)是目前药物无法控制的青光眼的主要治疗手段,但滤过道瘢痕化仍可导致手术失败。丝裂霉素(mitomycin C,MMC)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是临床常用的两个药物,但有很多严重的并发症。所以,在临床上迫切需要寻求一种新的、有效的、安全的、副作用小的抗青光眼滤过术后瘢痕化的药物。
近几年研究表明,PPARγ在许多器官纤维化的发生路径进行调节,被认为是治疗纤维化的重要的靶点。那么,PPARγ是否同样也参与青光眼滤过术后瘢痕化的调节呢?PPARγ激动剂能否作为一种抑制青光眼滤过手术瘢痕化的新药物呢?
研究方法：
本课题通过原代培养人Tenon’s囊成纤维细胞(human tenon’s fibroblasts,HTFs),体外研究两种不同类型的PPAR-γ配体激动剂15d-PGJ2和罗格列酮对HTFs增殖及TGF-β2诱导的细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)合成的影响,及其作用机制。
1、组织块贴壁法原代培养HTFs并鉴定,免疫荧光法、RT-PCR、Western bolt检测PPARγ在HTFs细胞中的表达。
2、不同浓度的PPARγ激动剂15d-PGJ2和罗格列酮体外作用于HTFs细胞,(1)MTT法检测细胞增殖,台盼蓝染色检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期变化；(2)实时定量PCR、Western blot检测细胞分泌TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的表达水平。
3、应用5ng/ml的TGF-β2体外刺激HTFs细胞,来模拟体内滤过术后瘢痕化的过程。(1)应用15d-PGJ210μM、罗格列酮20μM、GW966210μM分别作用于5ng/ml的TGF-β2刺激的HTFs细胞,细胞计数、RT-PCR、Western blot检测细胞增殖数目及细胞外基质α-SMA、FN、CollagenⅠ的表达水平。(2)检测不同剂量TGF-β2刺激HTFs细胞不同时间点Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达。免疫荧光、RT-PCR、Westernblot、ELISA检测5ng/ml的TGF-β2刺激的HTFs细胞Smad2/3、p-Smad2/3表达。统计学分析
各组实验数据以平均值±标准差((x)±s)表示,采用SPSS12.0软件分析。多组间比较采用ANOVA分析,直线Pearson相关分析,率的比较采用卡方检验,取双侧α值为0.05,以P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有显著统计学意义。
结果：
1、成功原代培养HTFs细胞,HTFs细胞呈长梭形,具有成纤维细胞的一般特性:波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。在HTFs细胞中,PPARγ在组织学、mRNA水平、蛋白水平均表达。
2、抑制HTFs细胞的增殖和TGF-β的分泌
(1)15d—PGJ2和罗格列酮均能有效的抑制HTFs细胞的增殖和干预细胞周期,并呈剂量相关性,但对细胞存活率并无影响。15d-PGJ2的药物半数致死率(IC50)为13.497μM,罗格列酮为21.622μM。15d-PGJ2可能将细胞阻止在S期,或者延缓向G2/M期的转化。而罗格列酮则是可能将细胞阻止在G1期,延缓向S期的转化。
(2)罗格列酮明显抑制HTFs细胞分泌TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 mRNA和蛋白表达,而15d-PGJ2则对TGF-β分泌没有明显影响。
3、抑制TGF-β2诱导的HTFs细胞增殖和细胞外基质的合成
(1)15d-PGJ2和罗格列酮均能有效抑制TGF-β2诱导的HTFs细胞增殖和细胞外基质α-SMA、FN、CollagenⅠ的合成。当PPARγ拮抗剂GW9662阻断PPARγ活性以后,15d-PGJ2抑制TGF-β2刺激的HTFs细胞增殖和细胞外基质α-SMA、CollagenⅠ合成的作用被减弱,而对抑制FN的合成无影响。GW9662则可以减弱罗格列酮抑制TGF-β2刺激HTFs合成FN,CollagenⅠ的合成,而对其抑制细胞增殖和α-SMA的合成无影响。
(2)TGF-β2刺激细胞内的p-Smad2/3表达水平增高,呈剂量依赖性。15d-PGJ2、罗格列酮可以抑制TGF-β2的这种刺激作用,GW9662可以减弱15d-PGJ2对p-Smad2/3表达抑制的作用,但只能部分减弱罗格列酮的抑制作用。GW9662对TGF-β2和Smad2/3的活性无影响。
结论
1、PPARγ在正常人原代培养的人眼Tenon’s囊成纤维细胞中表达。
2、15d-PGJ2通过将细胞阻止在S期,或者延缓向G2/M期的转化抑制HTFs细胞的增殖。而罗格列酮则是将细胞阻止在G1期,延缓向S期的转化。均呈剂量依赖性,并且无明显的细胞毒性。
3、罗格列酮能够抑制HTFs细胞分泌TGF—β1、TGF-β2、TGF-β3 mRNA和蛋白表达,而15d-PGJ2则对TGF-β分泌没有明显影响。
4、15d-PGJ2和罗格列酮均能有效的抑制TGF-β2诱导的HTFs细胞增殖和细胞外基质的合成,抑制作用一部分依赖结合PPARγ,同时也有部分不依赖PPARγ。其中依赖PPARγ的作用是通过干预磷酸化Smad2/3的合成来抑制TGF-β/Smad通路,通过类似于PPARγ/TGF-β/Smad信号通路完成的。
5、罗格列酮有心脏毒性、黄斑水肿等副作用,15d-PGJ2有希望成为一种新的抗青光眼术后瘢痕化的新药物,但尚需要进一步动物实验明确其确切的抑制效果。