随着人口逐渐老龄化,脑血管病的发病率逐年升高,现已成为严重危害人类健康的常见病和多发病之一,其致残率及致死率都很高,而缺血再灌注性脑血管病的发病率约占脑血管病的75％,因此,研究脑缺血再灌注性损伤发生的机制成为当今医学界紧迫的任务。有传统观点认为,脑缺血再灌注损伤后的细胞死亡是直接坏死的过程。随着对脑缺血损伤机制研究的日益深入,细胞凋亡在脑缺血再灌注中的作用引起关注。研究表明,神经元凋亡是缺血性脑损伤后细胞死亡的重要形式。细胞凋亡受多种相关基因及其蛋白调控,其中细胞色素C(cytochrome-c,cyt-c)、B细胞淋巴瘤／白血病-2(B cell lymphoma／lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2Assaciated X protein,Bax)基因及其蛋白与细胞凋亡关系最密切。黄芪注射液为临床治疗缺血再灌注性脑血管病的常用药物,可抑制细胞凋亡的发生,但具体通过何种信号转导通路抑制细胞凋亡,其机制尚未完全阐明。因此本课题通过观察黄芪注射液对缺氧缺糖／复氧复糖后海马神经元cyt-c、bcl-2、bax基因及蛋白表达的影响,探讨黄芪注射液对缺血再灌注脑组织海马神经元保护作用的分子机制。　　 第一部分乳鼠海马神经元体外培养纯度鉴定　　 目的:　　 检测体外原代培养乳鼠海马神经元纯度。　　 方法:　　 取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为2组:正常组、阴性对照组。采用细胞免疫化学法检测海马神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific Enolase,NSE)表达,进行海马神经元纯度鉴定。　　 结果:　　 体外原代培养海马神经元形态学观察和纯度鉴定。　　 细胞免疫化学结果显示:无血清培养8 d的海马神经元胞体饱满,突起明显、突起末端分支形成神经网络,相互支持生长,神经胶质细胞少见,3～4个视野中阳性神经细胞的数目为72个,纯度为(92.50±0.52)％。　　 结论:无血清培养8 d的乳鼠海马神经元,纯度大于72％,适于细胞学实验。　　 第二部分黄芪注射液对缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2、bax表达的影响　　 目的:　　 观察黄芪注射液对缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关蛋白bcl-2、bax及其mRNA表达的影响,探讨黄芪注射液抑制海马神经元凋亡的作用机制。　　 方法:　　 取原代培养8 d的乳鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖／复氧复糖组)、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外,其余各组均进行缺糖缺氧0.5 h,再复氧复糖。分别于复氧复糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h采用细胞免疫化学法、western blot法检测海马神经元bcl-2、bax蛋白的表达,RT-PCR法检测海马神经元bcl-2、bax mRNA的表达。　　 结果:　　 细胞免疫化学结果显示:正常对照组大鼠海马神经元核规整,突起明显,有少许胞浆黄染；模型组大鼠海马神经元核皱缩、突起回缩,大量胞浆黄染,胞核内有少许黄色颗粒,除0 h外,海马神经元bcl-2、bax蛋白阳性表达在各个时间点均比正常对照组明显增多(P<0.05)；黄芪注射液溶剂对照组海马神经元形态变化和海马神经元bcl-2、bax阳性表达与模型组一致(P>0.05)；黄芪注射液组大鼠海马神经元有轻微核皱缩,可见部分神经元胞浆黄染,除0 h时间点之外,海马神经元bcl-2蛋白阳性表达在相对应时间点均比模型组明显增高,而海马神经元bax蛋白阳性表达在各个时间点均比模型组明显降低(P<0.05)。Western blot和RT-PCR结果显示:与正常对照组相比,模型组bcl-2、bax蛋白及mRNA表达明显升高,而bcl-2／bax比值下调(P<0.05)。与模型组相比,黄芪注射液组bcl-2蛋白及mRNA表达升高,bax蛋白及mRNA表达明显降低,而bcl-2／bax比值升高(P<0.05)；而黄芪注射液溶剂对照组bcl-2、bax蛋白及mRNA表达及其比值与模型组相比则无显著变化(P>0.05)。　　 结论:　　 1.缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2蛋白及其mRNA表达和bcl-2／bax比值降低,而bax蛋白及其mRNA表达增高,与海马神经细胞神经元凋亡相一致,提示bcl-2、bax及其bcl-2／bax比值可能参与了缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经细胞神经元凋亡。　　 2.黄芪注射液可提高缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2表达,抑制bax表达,提高bcl-2／bax比值,从而抑制缺氧缺糖／复氧复糖引起的海马神经元凋亡。　　 第三部分黄芪注射液对缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元cyt-c蛋白表达的影响　　 目的:　　 观察黄芪注射液对缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元cyt-c蛋白表达的影响。　　 方法:　　 实验分组和造模方法同第二部分。采用细胞免疫化学法和western blot法检测海马神经元cyt-c蛋白的表达。　　 结果:　　 细胞免疫化学结果显示:正常对照组大鼠海马神经元核膜完整,突起明显,有少许细胞胞浆黄染；模型组大鼠海马神经元胞核皱缩、突起回缩,大量细胞胞浆黄染,胞核内有少许黄色颗粒,海马神经元cyt-c蛋白阳性表达除外0 h,在其余各个时间点均比正常对照组明显增多(P<0.05)；黄芪注射液溶剂对照组神经元形态变化和海马神经元cyt-c蛋白阳性表达与模型组表达一致(P>0.05)；黄芪注射液组大鼠海马神经元有轻微核皱缩,可见部分神经元胞浆黄染,除0 h时间点外,海马神经元cvt-c蛋白阳性表达在余各个时间点均比模型组相对应时间点明显减少(P<0.05)。Western blot结果显示:与正常对照组相比,除0 h时间点外,模型组余各个时间点cyt-c蛋白表达明显升高(P<0.05)；与模型组相比,除0 h时间点外,黄芪注射液组余各个时间点cyt-c蛋白表达明显降低(P<0.05)；而黄芪注射液溶剂对照组cyt-c蛋白表达则无显著变化(P>0.05)。　　 结论:　　 1.缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元cyt-c蛋白表达增高,与海马神经元凋亡相一致,提示cyt-c可能参与了缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元凋亡。　　 2.黄芪注射液可抑制缺氧缺糖／复氧复糖大鼠海马神经元cyt-c蛋白表达,从而抑制缺氧缺糖／复氧复糖引起的海马神经元凋亡。