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细胞色素P450 (Cytochrome P450, P450)是庞大的家族酶系,在昆虫内源及外源化合物代谢中发挥着重要作用。飞蝗(Locusta migratoria)是重要的农业害虫,揭示其体内P450代谢解毒功能对飞蝗有效治理尤为必要。本文以飞蝗2个P450基因CYP408B1和CYP409A1为靶标,将其分别转入果蝇(Drosophila melanogaster)体内,成功建立了转基因果蝇品系,测定了果蝇对杀虫剂的敏感性以及P450总酶活性；针对CYP408B1和CYP409A1构建了重组质粒,利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统进行体外异源共表达,为探索飞蝗CYP408B1和CYP409A1基因对杀虫剂的代谢解毒功能提供依据。本文主要研究内容有：一、飞蝗2个P450转基因果蝇品系对杀虫剂的敏感性研究采用转基因技术成功构建了转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的纯合果蝇品系,分别选择雄性转基因果蝇UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和亲本果蝇attp40与tub-ga14的处女果蝇杂交,提取子一代启动目的基因CYP408B1和CYP409A1表达的转基因果蝇品系tub>CYP408B1和tub>CYP409A1以及对照组果蝇品系tub>attp40的DNA和总RNA,将RNA体外反转录为cDNA。分别以DNA和cDNA为模板,进行PCR扩增,从而验证构建好的转基因果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1。以DNA为模板的PCR扩增结果显示,实验组tub>CYP408B1和tub>CYP409A1中均可检测到目的条带,大小分别为1 555 bp和1585 bp,表明已成功的将飞蝗CYP408B1和CYP409A1插入果蝇体内；以cDNA为模板的RT-PCR和RT-qPCR,实验组中均有目的条带且表达量较高,表明转基因果蝇品系tub>CYP408B1和tub>CYP409A1中目的基因均可大量表达。通过杀虫剂生物学测定,进一步分析了转基因果蝇品系tub>CYP408B1、 tub>CYP409A1以及对照组tub>attp40、UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和attp40对溴氰菊酯、马拉硫磷和毒死蜱3种杀虫剂的敏感性,实验结果显示：实验组tub>CYP408B1和tub>CYP409A1对溴氰菊酯的抗药性均较对照组为高,且与tub>attp40相比,抗性比分别为1.59和1.83,而对马拉硫磷和毒死蜱的抗性比并未提高。采用荧光法定量测定转基因果蝇品系tub>CYP408B1、tub>CYP409A1以及对照组tub>attp40中细胞色素P450的总酶活性,测定结果显示：实验组tub>CYP408B1和tub>CYP409A1的总酶活性与对照组tub>attp40相比,均无显著性差异。二、飞蝗2个P450基因的原核表达采用ompA+2策略对飞蝗CYP408B1和CYP409A1的氮端进行修饰,依次插入表达载体pCWori的NdeI处；采用pelB策略修饰飞蝗CPR (NADPH细胞色素P450还原酶)的氮端,首先同上插入pCWori,随后再转入带有p15A的表达载体pAC-Kan-alphaGal4中,从而完成重组质粒(pCW/CYP408B1、pCW/CYP409A1和pAC/CPR)的构建。通过PCR和测序鉴定构建的重组质粒,PCR鉴定结果显示：片段大小分别为1642 bp、1 654 bp和2143 bp,大小与预期相近,且测序结果表明插入的基因序列正确无误。将构建好的重组质粒pCW/CYP408B1和pCW/CYP409A1分别与pAC/CPR在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中进行共表达或单独表达。不同条件诱导的原核表达检测结果显示：CYP409A1和CPR均可表达,蛋白分子量分别约为58ku和77ku,但均为包涵体,而CYP408B1未能成功表达。综上所述,本文利用转基因技术成功构建了转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1,且通过生物测定揭示飞蝗CYP408B1和CYP409A1均对溴氰菊酯具有一定的解毒功能。同时,本文成功构建了重组质粒pCW/CYP408B1、pCW/CYP409A1和pAC/CPR,利用大肠杆菌原核表达系统,经不同诱导条件对上述两个基因进行了原核表达,探讨了飞蝗CYP408B1和CYP409A1基因对杀虫剂的代谢功能,为相关研究提供了理论和实验依据。