骨肉瘤是青少年最常见的原发骨肿瘤，最常侵犯四肢长骨干骺端。这种高度侵袭性的肿瘤在组织病理学上主要由产生异常类骨质或不成熟骨的纺锤形恶性间质细胞组成，具有局部侵袭迅速、发生肺转移早的特点。超过90%的患者在多药物化疗前就死于肺转移。与其他肉瘤在遗传特征上具有特定染色体易位不同，骨肉瘤以包括高度非整倍性、不平衡性染色体重排的聚集与多区域的扩增与缺失在内的基因组不稳定性为鲜明特征。由于对多种化疗敏感性较差，对骨肉瘤的治疗在过去20年仅仅取得非常微小的进展。目前，局灶性骨肉瘤患者总体5年生存率约为60%⁷5%，但在发生远处转移的患者中降至15%³0%。对于复发的病例，其预后仍不十分理想，只有不到20%能长期生存。因此，进一步探讨骨肉瘤发生、发展的分子机制对临床开发新的治疗靶点尤为重要。线粒体是真核细胞内重要的半自主性细胞器，拥有唯一独立于细胞核基因组的遗传物质，即线粒体DNA （mitochondrial DNA, MtDNA），在能量代谢、氧自由基的产生、维持钙稳态、细胞凋亡、衰老以及肿瘤中发挥着极为重要的作用。人类MtDNA是由16569个碱基对（Base pair,bp）组成的双链闭合环状超螺旋结构，编码13个电子呼吸链相关多肽、22个tRNA （transfer RNAs）以及2个rRNA （ribosomal RNAs）。MtDNA含有一个叫做D环（D-loop）的1124bp的非编码区域，主要负责MtDNA的转录与复制。人类每个细胞包含103¹04个线粒体，每个线粒体DNA约有2¹0个基因拷贝。与核基因组DNA比较，MtDNA具有缺乏内含子和组蛋白的保护、离内源性氧自由基更近以及修复能力不完善等特点，使它更易于受到活性氧族（Reactive Oxygen Species,ROS）及其他基因毒性的损害，导致MtDNA发生异常改变。除线粒体基因组，特别是突变热点--D环区域发生序列改变外，MtDNA含量的变化已在多种原发性实体肿瘤或肿瘤患者白细胞中被发现，且具有显著的肿瘤特异性。在头颈部肿瘤、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌以及食管鳞癌中表现为升高，而在胃癌、乳腺癌、Ewing’s肉瘤、肝细胞癌、非小细胞肺癌和肾细胞癌中则表现为拷贝数降低。更为重要的是，MtDNA含量的变化还与某些肿瘤的恶性转化、肿瘤进展、转移以及预后密切相关。然而，针对骨肉瘤MtDNA含量变化及其可能的诊断或治疗价值的研究，未见文献报道。此外，MtDNA究竟在骨肉瘤细胞中发挥怎样的作用、线粒体基因组与核基因组通过怎样的分子遗传学机制相互作用，至今仍不十分清楚。针对上述问题，本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应（QRT-PCR）对20例骨肉瘤组织以及5例正常骨组织MtDNA含量进行了定量检测，并分析MtDNA含量变化与患者主要临床病理特征之间的关系。在补充外源性尿苷和丙酮酸钠的条件下，采用长期低剂量溴化乙锭诱导，分离、鉴定，获得骨肉瘤MtDNA耗竭（MtDNA depleted）细胞即ρ0细胞，并检测了ρ0细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移以及裸鼠体内成瘤能力。同时，通过检测ρ0细胞转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGFB1）及其受体TGFBR1的mRNA表达水平，探索ρ0细胞在失去MtDNA后表现出特定生物学特性的可能机制；通过对TGFBR1单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）与肿瘤发病风险的关系进行meta分析，揭示其与肿瘤发病风险的关系。通过上述研究以期初步探讨MtDNA在骨肉瘤发生、发展中的作用及相关机制，为进一步揭示MtDNA及相互作用分子在骨肉瘤分子生物学行为中的作用提供实验依据，为骨肉瘤的可能分子靶点的研发提供新的思路。实验方法和主要结果1.人骨肉瘤组织线粒体DNA含量变化及其临床意义方法：以正常骨组织为对照，通过荧光定量PCR法检测了20例骨肉瘤组织线粒体DNA的相对含量；结合骨肉瘤主要临床病理参数，探讨MtDNA含量变化与肿瘤的发生、发展之间的关系。结果：骨肉瘤组织平均线粒体DNA相对含量（120.87±32.6）明显低于骨组织平均线粒体DNA相对含量（422.15±93.6），降低了约71%，两者之间差异有显著统计学意义（P=0.000）；骨肉瘤线粒体DNA含量与患者年龄（P=0.697）、性别（P=0.505）、病理学类型（P=0.364）、肿瘤部位（P=0.895）均未见明显相关性，而在转移组中明显低于非转移组（P=0.003），差异具有显著统计学意义。2.线粒体DNA耗竭骨肉瘤细胞系ρ0-SaOS2细胞的建立方法：用加入100μg/ml丙酮酸钠、50ng/ml尿苷以及50ng/ml溴化乙锭的特殊培养基，按照常规细胞培养法培养、诱导SaOS2细胞。于诱导第7、14、21、28d观察细胞形态，收集培养细胞，提取全基因组DNA，并用荧光定量PCR法检测线粒体DNA的相对含量。结果：经溴化乙锭处理28d后（后经鉴定为ρ0细胞），SaOS2细胞变得更梭更长，部分细胞触角变长；随着特殊培养时间的增加，与亲本骨肉瘤SaOS2细胞相比，线粒体DNA相对含量逐渐降低，在第7、14、21、28d后，分别降为原细胞MtDNA含量的（1/2）^4.1、（1/2）^7.2、（1/2）^11.1、（1/2）^13.13。由此，我们获得了MtDNA耗竭细胞（ρ0-SaOS2）。3.线粒体DNA耗竭骨肉瘤细胞ρ0-SaOS2的生物学特征方法：利用Mito-Tracker Green探针、JC-1试剂盒检测细胞线粒体质量及线粒体膜电位，利用MTT法、平板克隆实验检测细胞增殖能力，流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡及失巢凋亡抵抗能力，通过划痕实验、Transwell法检测细胞迁移能力，Transwell法检测细胞侵袭能力，并利用裸鼠成瘤实验检测细胞的体内成瘤能力。结果：（1）与SaOS2细胞相比，ρ0-SaOS2细胞线粒体质量明显降低，提示ρ0-SaOS2细胞的线粒体数量减少；（2）利用线粒体膜电位检测试剂盒，我们发现SaOS2细胞中JC-1聚合物的量明显高于单体，而在ρ0-SaOS2细胞内恰好相反，提示ρ0-SaOS2细胞线粒体膜电位降低；（3） SaOS2细胞生长速度明显高于ρ0-SaOS2细胞（P＜0.05），差异显著；（4）与SaOS2细胞比较，ρ0-SaOS2细胞克隆形成能力降低25.5%，具有统计学意义（P=0.024）；（5） ρ0-SaOS2细胞的早期凋亡率与失巢凋亡率明显高于SaOS2细胞，早期凋亡率分别为（7.03%±0.62）与（3.73%±0.36），失巢凋亡率分别为（8.03%±0.24）与（4.77%±0.68），P＜0.05，差异具有统计学意义；（6）细胞划痕实验表明SaOS2细胞的迁移能力较ρ0-SaOS2细胞更强；（7） ρ0-SaOS2细胞与SaOS2细胞的迁移能力差异不明显。Transwell法检测细胞迁移能力，穿过小室面的SaOS2细胞数为（80.6±10.6）个/视野，而ρ0-SaOS2细胞为（68.3±10）个/视野，P=0.217，差异不具统计学意义；（8） ρ0-SaOS2细胞与SaOS2细胞的侵袭能力差异不明显。Transwell法检测细胞侵袭能力，穿过小室面的SaOS2细胞数为（53.6±8）个/视野，而ρ0-SaOS2细胞为（42.3±7.5）个/视野，P=0.149，差异不具有统计学意义；（9）裸鼠体内成瘤实验发现，SaOS2与ρ0-SaOS2细胞在裸鼠皮下均可形成移植瘤，但后者的潜伏期较长，所形成的瘤体体积也较小，差异具统计学意义（P＜0.01）。4. TGFB与TGFBR1在线粒体DNA耗竭细胞中的表达情况及TGFBR1单核甘酸多态性与肿瘤发病风险关系的meta分析方法：应用经典的总RNA提取—逆转录—实时定量PCR法检测了SaOS2细胞与ρ0-SaOS2细胞TGFB与TGFBR1mRNA表达情况。利用计算机检索截止2012年5月12日MEDLINE、Pubmed、科学引文数据库、EMBASE以及CBM数据库内有关TGFBR1TGFBR1*6A和IVS7+24G>A多态性与肿瘤发病风险关系的研究，根据纳入标准提取有效数据后，采用STATA软件选择显性、隐性、附加三种遗传模型进行meta分析。结果：（1）经实时荧光定量PCR测定，TGFB与TGFBR1在ρ0细胞中的表达水平显著高于其在SaOS2细胞中的表达水平（P＜0.01）。（2） Meta分析结果显示，TGFBR1*6A与肿瘤总体发病风险显著相关。种族亚组分析显示，来自美国的混合人群表现出明显的肿瘤易感性，而在高加索与亚洲人群中未见相关性。肿瘤类别亚组分析显示，TGFBR1*6A多态性与卵巢癌易感性显著相关，而与乳腺癌发病风险的相关性只在附加模型中体现。对于IVS7+24G>A，其多态性与肿瘤的总体易感性显著相关。种族亚组分析显示，亚洲人群表现出明显的肿瘤易感性，而在高加索以及混合人群中未见此现象。肿瘤类别亚组分析表明，IVS7+24G>A多态性与乳腺癌易感性显著相关，而与结肠癌发病风险的相关性只在隐性模型中得到体现。结论1.骨肉瘤组织中线粒体DNA含量较正常骨组织降低了71%，差异有统计学意义，且线粒体DNA含量与骨肉瘤的转移密切相关，而与年龄、性别、肿瘤部位以及肿瘤病理学类型均无相关性。这些证据表明线粒体DNA含量的降低可能与骨肉瘤发生、发展相关。2.通过溴化乙锭长期低浓度诱导SaOS2细胞，在第28d，成功地建立了线粒体DNA耗竭细胞系，即ρ0-SaOS2细胞，可用于MtDNA的相关功能研究。3.线粒体DNA耗竭ρ0-SaOS2细胞较其亲本SaOS2细胞的线粒体质量与线粒体膜电位降低，ρ0-SaOS2细胞的增殖能力降低，凋亡率及失巢凋亡率升高。另外ρ0-SaOS2细胞的成瘤潜伏期长，瘤体生长速度亦减慢。表明线粒体DNA的敲除效应对不同的细胞株的生物学特性的影响是不同的。4.线粒体DNA耗竭可以上调细胞TGFB1与TGFBR1的mRNA表达水平，提示这两个基因可能在线粒体DNA耗竭细胞的生物学特性改变中发挥重要作用。5.TGFBR1基因TGFBR1*6A和IVS7+24G>A多态性与肿瘤发病风险升高有关，提示：检测TGFBR基因上述两个SNP有助于从遗传角度评估肿瘤的发病风险。