本文研究目的：体外分离培养人牙髓细胞(humandentalpulpcells，HDPCs)并进行表型鉴定及诱导分化，加入人工重组Leptin(recombinanthumanLeptin，rhLeptin)，检测Leptin对HDPCs增殖、分化作用的影响。 研究方法：①收集因治疗需要拔除的年轻健康恒牙，无菌条件下取出牙髓组织，分别采用组织块法和酶消化法原代培养HDPCs，待细胞铺满瓶底80％时传代。②取第四代HDPCs采用MTT比色法测定细胞生长曲线，免疫组织化学方法行波形丝蛋白(Vimentin)和角蛋白(cytokeratin)的免疫染色，鉴定细胞来源。③取第2代HDPCs采用间接免疫荧光法检测血管周细胞表面抗原CD146的表达，对牙髓细胞中的未分化细胞进行鉴定。分别以成脂化培养基和矿化培养基诱导培养HDPCs，镜下观察细胞形态变化，28天后行油红O染色和VonKossa钙化染色。④取第4代HDPCs采用SABC法检测Leptin受体(Leptin-Receptor,LR)在牙髓细胞中的表达。⑤将培养基中加入不同浓度rhLeptin(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)培养HDPCs，3天后用MTT比色法检测细胞增殖情况。第4代HDPCs以含100ng/mLrhLeptin的培养基培养，对照组不含rhLeptin，3天后将细胞制成细胞悬液，采用流式细胞技术(flowcytometry,FCM)检测细胞各周期时相。⑥用加入不同浓度rhLeptin(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)的培养基培养HDPCs，对照组不含rhLeptin。于培养14天后检测各组细胞碱性磷酸酶(alkalinephophatase，ALP)活性水平，确定rhLeptin最佳作用浓度(100ng/mL)。⑦用含100ng/mLrhLeptin的培养基对HDPCs进行诱导培养，28天后观察钙化结节形成情况，并行VonKossa钙化染色。采用SABC法检测HDPCs矿化相关蛋白——牙本质涎蛋白(dentinsialoprotein，DSP)及骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)的表达情况。 研究结果：①采用组织块法培养HDPCs，牙髓组织块接种6～10天后，可见细胞从组织块周边呈辐射状游出，细胞呈长梭形，少量细胞形态不规则，细胞胞体较大，核仁清晰；采用酶消化法培养HDPCs，消化后的细胞于第2天开始贴壁生长，镜下见细胞呈梭形，胞体较小，部分细胞形态不规则呈多角形或椭圆形，个别细胞生长迅速，呈集落样生长，形成细胞克隆，克隆中心细胞密集，细胞间界限不清。②MTT法测得细胞生长曲线显示：1～3天HDPCs生长相对缓慢：从第3天开始进入指数增殖期，细胞数量持续升高；至第7天生长相对缓慢，细胞生长进入饱和期。细胞表型鉴定结果为波形丝蛋白阳性，角蛋白阴性。③对CD146的免疫荧光检测结果显示：牙髓细胞内存在少数CD146阳性细胞，提示牙髓组织中存在牙髓干细胞(Dentalpulpstemcells，DPSCs)，该细胞可表达血管周细胞抗原CD146。细胞在成脂肪化诱导培养4周后，可见部分细胞体积增大，胞浆内有透明脂滴形成，油红O染色为橙红色。矿化诱导4周后细胞可形成钙化结节，VonKossa钙化染色显示棕黑色钙化团块形成。④免疫组化表明在HDPCs细胞表面有Leptin受体表达。⑤加入不同浓度rhLeptin作用后，实验组细胞的增殖情况相对于对照组没有显著变化(P＞0.05)，流式细胞术结果提示了实验组和对照组细胞的细胞周期时相没有显著变化，差异没有统计学意义(x=0.38，P＞0.05)。⑥含不同浓度rhLeptin的实验组细胞ALP活性水平明显高于对照组(即DMEM组)，Leptin对HDPCs的ALP活性有促进作用，并呈一定量效关系(回归方程(^y)=0.291+0.0036x，回归系数检验t=6.49，P=0.003)，其最佳作用浓度为100ng/ml。⑦100ng/mL的rhLeptin诱导培养HDPCs4周后，VonKossa钙化染色阳性。SABC法对牙髓细胞矿化相关蛋白检测的结果显示：牙本质涎蛋白(DSP)及骨钙蛋白(OCN)表达阳性。 研究结论：①采用组织块法及酶消化法均可在体外成功培养出HDPCs。②体外培养的牙髓细胞内含有一定数量的牙髓干细胞，该细胞具有未分化的间充质干细胞的特性，表达血管周细胞表面抗原CD146，并在一定条件下可以向脂肪细胞及成牙本质细胞分化。③HDPCs表面有Leptin受体表达，Leptin对HDPCs的增殖无显著的促进作用，但可呈浓度依赖性刺激HDPCs向成牙本质细胞分化，并表达相应的矿化蛋白DSP及OCN。