神经管（neural tube）是发生中枢神经系统的始基,起源于胚体神经外胚层,在胚胎发育过程中,脊索诱导其背侧中线的神经外胚层形成神经板并发育成神经管。神经管缺陷（neural tube defects,NTDs）也被称作神经管畸形,在胚胎早期发育时,因神经管不能闭合或闭合不完整导致,是发病概率仅次于先天性心脏病的一种常见先天性畸形。NTDs的起因非常复杂,可能由受环境和遗传因素相互作用引起的。目前,临床上常通过在妊娠前和妊娠早期额外摄入适量叶酸有效降低NTDs发病（约70%）。但是有些NTDs单纯通过补充叶酸并不能有效的预防。当SHROOM3基因缺失发生神经管闭合不全时,无法单纯通过叶酸补偿来预防和治疗,甚至发现过多的叶酸补偿会导致胚胎的致死性增加。其内在机制由于缺乏合适的动物模型,该基因在人类NTDs发生过程中的作用及机理尚不清楚。非人灵长类与人类大脑在生理结构、发育的空间和时序性上有高度相似性,因此利用非人灵长类模拟人类NTDs,可以在在体外和体内共同探究其发病机制,有望为药物和干细胞移植临床前治疗的有效性和安全性研究提供重要的研究平台。为了探究SHROOM3基因突变如何影响灵长类神经管缺陷,我们开展了相关实验,主要研究内容和结果如下:1.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建SHROOM3基因敲除食蟹猴胚胎及获得SHROOM3基因突变的食蟹猴胚胎干细胞（cynomolgus monkey embryonic stem cells,cmESC）。针对食蟹猴SHROOM3基因的5号外显子设计sgRNA,在胚胎水平验证打靶效率,选择工作效率最高的两个sgRNA和sp Cas9的mRNA共同注射到食蟹猴1-细胞期胚胎,获得SHROOM3基因突变的胚胎。确定可以获得SHROOM3基因突变的胚胎后,利用发育到囊胚的胚胎建立ES细胞系获得SHROOM3基因突变的cmESC。2.SHROOM3基因在体外神经分化过程中的表达时间窗口建立了体外神经上皮干分化体系,该过程设置了5个时间点来探究SHROOM3基因在整个发育过程中表达的时间窗口以及表达水平。实验结果表明,在胚胎干细胞时SHROOM3基因已经表达,且在体外神经分化过程中持续表达,Rosettes结构形成时期SHROOM3基因表达达到了较高水平。这些数据表明SHROOM3基因在神经系统发育过程中可能扮演着非常重要的角色,推测神经管闭合与SHROOM3基因具有重要的关系。3.研究正常及SHROOM3基因突变cmESC体外神经分化潜能在体外建立神经上皮干细胞分化体系基础上,将ES诱导成神经上皮干细胞（neuroepithelium stem cell,NESC）。通过免疫荧光染色、RT-PCR、Western blot以及q PCR等技术,在野生型（Wildtype,WT）和SHROOM3mut-ESC从胚胎干细胞体外分化过程中取ES,神经花环（Neural Rosettes,NRs）,微小类神经管结构（Neural tubes-like,NTs）以及后期NESC分化的细胞这些时间点进行检测,分析正常和突变细胞体外分化能力。发现SHROOM3促进ES细胞神经定向分化;SHROOM3基因缺失影响胚胎干细胞向外胚层分化的能力;SHROOM3基因缺失使神经上皮干细胞向神经元和胶质细胞分化能力增强,但是会使影响大脑可塑性的OTX2表达量降低。没有SHROOM3的情况下,Wnt信号传导没有受到明显阻断;SHROOM3基因突变可能会影响细胞生长速率、形态等。结论:SHROOM3基因在神经发育系统中可能扮演非常重要的角色。在体外,cmESC的SHROOM3基因突变会影响ESC在体外分化过程中的细胞生长速率、细胞形态,以及向外胚层分化的能力。SHROOM3基因突变可能会影响到神经分化的潜能,但并不通过直接阻断Wnt信号通路来影响神经管的闭合。SHROOM3基因突变导致猴神经管缺陷的具体分子机制仍有待进一步研究。