论文部分内容阅读
目的:构建四环素反应元件(Tetracycline Response Element,TRE)调控的重组基因酵母细胞,用于快速检测动物食品中四环素类抗生素的残留。方法:1.用PCR方法从酵母DNA提取液中扩增GPD(3-磷酸甘油醛脱氢酶,Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydro-genase)基因启动子,将其插入到酵母表达载体pYESTrp2,从而构建GPD 启动子驱动的酵母表达载体pGPD。2.人工合成双股V5抗原表位DNA,将其插入pGPD载体;以质粒pcDNA6/TR为模板,PCR扩增四环素阻逆蛋白(Tetracycline Repressor Protein,tetR)基因,并与pGPD载体的V5抗原表位DNA相融合,构建成GPD驱动的TR酵母表达载体,并转化于酵母细胞W303-1A,用Western blot方法鉴定tetR基因的表达。3.人工合成四环素反应元件(Tetracycline Response Element,TRE),将其插入pMP206酵母报告载体的CYC1启动子与报告基因Lac Z(β-半乳糖苷酶基因)之间,构建成TRE调控的Lac Z酵母报告载体pyTeton-Lac Z。4.以pYESTrp2载体为模板,PCR扩增GAL1(半乳糖诱导型启动子基因)启动子,取代pyTeton-Lac Z载体上的CYC1(细胞色素氧化基因)启动子,构建成GAL1驱动TRE调控的Lac Z酵母报告载体,并转化于可高效表达TR的酵母细胞中,对阳性克隆用四环素进行诱导,分析其灵敏度和特异度。5.从扬州市某养猪场收集146例猪尿样本,以ELISA方法作为金标准,用重组酵母细胞方法对其尿液中四环素类抗生素进行检测,与金标准方法进行比较分析研究。结果:1.经PCR鉴定发现GPD启动子、tetR基因已成功转化于W303-1A酵母细胞,片段大小与预期的基因片段大小一致;用Western blot方法分析,tetR基因已成功在酵母细胞中表达,蛋白大小为22KD。2.经PCR鉴定发现GAL1驱动的TRE调控的重组Lac Z酵母细胞构建成功;所构建的四环素调控的重组酵母细胞与四环素类抗生素有明显的剂量效应关系,而与非四环素类抗生素无剂量效应关系,说明有良好的灵敏性和特异性。3.重组酵母方法与ELISA方法比较发现,两种方法测定的阳性率有统计学差异(χ2=22.56,P=1.881×10-6<0.01)。经ROC曲线分析,发现重组酵母方法的灵敏度为76.36%,但是,其特异度和符合率不高,分别为43.96%和56.16%;约登指数为0.203,阳性似然比(+LR)为1.363,阴性似然比(-LR)为0.538,阳性预测值为45.16%,阴性预测值为75.47%;重组酵母方法与ELISA法均可发现混合四环类抗生素之间的联合效应,但是,重组酵母对四环类抗生素混合物联合作用相对较敏感。结论:所构建的重组酵母细胞(W303-1A/TR-GAL1-Teton-Lac Z)对四环类抗生素混合物联合效应较敏感,对家畜尿液中四环类抗生素残留有一定程度的快速筛检作用,但是,其特异度和灵敏度还需进一步研究提高。