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液相色谱(LC)对变性蛋白复性是近年来迅速发展起来的一种新的方法,它能够显著地提高蛋白复性效率,并同时使蛋白得到纯化,目前已成为国际上的研究热点。本论文先对大肠杆菌(E. coli)表达的rhGM-CSF进行了发酵工艺和放大工艺的研究和优化,得到高表达、高产量的包涵体,然后分别用疏水色谱(HPHIC)、离子交换色谱(HPIEC)、排阻色谱(SEC)对rhGM-CSF进行了复性并同时纯化。 论文包括以下五个部分: 1.前言 简要的介绍了蛋白质复性的意义,对近年来发展起来的蛋白质复性新方法进行了系统地综述。对rhGM-CSF的复性及分离纯化研究进展进行了评述。引用文献99篇。 2.rhGM-CSF摇瓶发酵工艺和放大工艺的研究 通过摇瓶发酵对大肠杆菌DH5α/pDH生产rhGM-CSF的培养基、培养温度、诱导时机、诱导维持时间、接种量等进行了研究,选择了较好的摇瓶培养条件。结果表明,大肠杆菌适宜在32℃进行培养,在对数生长前期升温至42℃诱导4～5小时,可获得较高的表达量rhGM-CSF。同时进行了发酵工艺的放大研究。 3.HPHIC对rhGM-CSF复性并同时纯化 成功应用高效疏水色谱(HPHIC)对E. coli表达的rhGM-CSF进行了复性和纯化,研究了固定相、盐种类、流动相pH、流动相中脲浓度,GSH/GSSG比例等因素对rhGM-CSF复性和纯化的影响。在优化条件下,经一步HPHIC可以得到比活为1.58×10~7IU/mg,纯度为95.7%,质量回收率为56.8%的rhGM-CSF。 4.HPIEC对rhGM-CSF复性并同时纯化 采用HPIEC法成功对7.0mol/L盐酸胍变性的rhGM-CSF进行了复性并同时纯化,考察了流动相pH、流动相中脲浓度、GSH/GSSG比例等因素对rhGM-CSF复性的影响。结果表明,GSSG/GSH可有效提高rhGM-CSF二硫键的正确对接和复性效率,而低浓度的脲则可有效抑制蛋白沉淀,可大大提高质量回收率。在最优化条件下,HPIEC一步可使rhGM-CSF在分离纯化的同时进行复性,其比活为