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背景与目的:炎性上呼吸道疾病,特别是慢性鼻窦炎(Chronic Rhinosinusitis,CRS),在世界范围内广泛流行。CRS涉及持续和严重的炎症反应,这类炎症反应与一些特定的免疫基因和蛋白质表达水平调节密切相关,但是,CRS病理过程中关键的免疫分子和调控机理尚不清楚。T细胞免疫反应已经被证明在包括CRS等众多上呼吸道炎症疾病中发挥重要的致病作用。最近研究表明,Th17也在炎性上呼吸道疾病的病理生理学中发挥重要作用。在T细胞免疫中,Th17细胞亚群是一种独特的CD4+T细胞谱系,其特征之一是分泌IL-17A。Th17细胞可以促进CRS中的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞聚集和功能的发挥。此外,一些证据表明,在CRS病理过程中,Th17应答也受到内源性和外源性物质的调节。除了 CRS病理过程中的免疫细胞外,鼻粘膜上皮细胞也参与着鼻腔免疫微环境的构建。同时,在有鼻息肉的CRS中,鼻息肉被认为是通过上皮间质转化这一过程产生的,上皮细胞也参与着上皮间质转化的过程。在炎症反应和上皮间质转化过程中,鼻粘膜上皮细胞对Toll样受体的刺激可以导致明显的炎症反应。这些刺激不仅可以激活上皮细胞表达趋化因子和细胞因子,与此同时,上皮细胞还产生许多参与宿主防御的识别分子,介导后续的免疫反应。微小RNA(microRNAs,miRNA)是一类新发现的基因表达调节分子,miRNA是一类短单链RNA分子。miRNA可通过降低靶mRNA表达或抑制其翻译而导致基因下调或沉默。miRNA的表达失调已经在各种疾病中被报道,包括癌症,炎性皮肤和肠病,类风湿性关节炎和哮喘。虽然炎症性上呼吸道疾病中miRNA的研究相对较少,但这些报道都表明miRNA参与了上呼吸道炎症的形成。也有大量的报道表明,miRNA参与着Th17免疫反应的调控过程。本次研究中将以miRNA-9与IL-17A作为切入点,研究IL-17A在CRS炎症过程中的作用,并探讨miRNA-9的调控机制。研究内容和方法:1.临床样本分析:收集鼻粘膜组织及血清样本,-80度保存,用于检测miR-9和IL-17A的表达水平及两者间的相关性;对部分慢性鼻窦炎病理样品进行HE染色、Masson染色、Tunel染色、阿利新蓝染色、免疫组化检测。2.靶点确认:根据生物信息学预测miR-9的靶基因,确认miRNA的靶点。构建IL-17A3’UTR野生型/突变型质粒,与miR-9 mimics共转染细胞,双荧光素酶实验检测二者的靶向调控作用。3.miRNA-9/IL-17A体外实验调控机制分析:分析中miRNA-9/IL-17A/FOXP3的表达水平变化;qPCR检测细胞中miRNA-9、IL-17A、FOXP3的转录水平;miR-9差异表达对细胞中miRNA-9/IL-17A/FOXP3的影响;miR-9与IL-17A共同作用对细胞功能的影响。结果:慢性鼻窦炎患者(CRSwNP)具有明显的Th17免疫反应和被抑制的Treg免疫反应,鼻粘膜组织的miR-9水平与血清IL-17A的水平呈现明显的负相关性。位点突变的IL-17A突变型质粒,在与miR-9共转染的过程中,相较于对照组,miR-9可以明显抑制野生型IL-17A质粒组的荧光素报告基因活性;但miR-9无法抑制结合位点突变组的荧光表达,该结果说明结合位点预测正确。在体外正常人鼻粘膜上皮细胞HNEpC与不同浓度的LPS进行刺激可见随着LPS的浓度增加,miR-9和FOXP3的转录水平明显下降,而IL-17A的转录水平相应随之升高,并且在LPS的浓度达到10 μg/mL时达到最高;Western blot结果与转录水平正相关,FOXP3的表达水平随着LPS的浓度增加逐渐降低,而IL-17A的表达则逐渐升高。miR-9抑制剂对LPS刺激的影响试验中,在LPS刺激后24 h,48 h,72 h细胞的增殖和凋亡各组没有明显差异,故后续实验时间节点确定为48 h;同时分析 miR-9、IL-17A、FOXP3、MMP-9、E-Cadherin、N-Cadherin 分子的转录表达水平。结果显示miRNA-9、FOXP3在miR-9抑制剂组转录水平明显下降,IL-17A、N-Cadherin转录水平表达明显提高,E-Cadherin在miR-9抑制剂组的转录表达水平都有下降,而MMP-9的转录水平升高。E-Cadherin、IL-17A、N-Cadherin的免疫荧光结果与western blot结果一致。在miR-9对IL-17A过表达的情况的调节结果显示,在IL-17A过表达的情况下,FOXP3,E-Cadherin的转录表达水平均有明显的下调,而MMP-9和N-Cadherin转录表达水平均明显上调,同时,Wnt3a的表达水平也有明显的上调。结论:通过以上结果表明,在慢性鼻窦炎过程中,有明显的Th17炎症反应参与,导致鼻腔的炎症反应和上皮间质转化,也可见miR-9的参与;IL-17A作为典型的Th17炎症细胞因子,受到miR-9的调控,在调控过程中,Treg免疫反应相应的上调,而上皮间质转化受到一定的抑制,这提示着miR-9/IL-17A通路在慢性鼻窦炎病理过程中发挥着重要的作用。