研究背景支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是1967年由Northway等首次报道并命名,是目前早产儿最常见也是最棘手的的慢性呼吸系统疾病之一。1979年Bancalari等将BPD定义为：(1)患呼吸衰竭的新生儿；(2)需要机械通气至少3d并且持续给氧超过28d；(3)有呼吸困难的体征和肺部的放射学表现。这个定义在1980～1990年之间被广泛作为诊断标准,后曾用新生儿慢性肺疾病(chronic lung disease,CLD)这一术语替代。在2000年6月由美国多家国立卫生研究机构共同举办的BPD研讨会上一致通过仍用BPD这一名称替代CLD,以在流行病学、病因和预后等方面与发生在婴儿期的其他慢性肺疾病区别,同时制定了BPD新定义及分度。新型BPD是指任何氧依赖(>21%)超过28天的新生儿,如胎龄<32周,根据校正胎龄36周或出院时需FiO2分为：①轻度：未用氧；②中度：FiO2<30%;③重度：FiO2≥30%或需机械通气。如胎龄≥32周,根据生后56天或出院时需FiO2分为上述轻、中、重度。肺部X表现不应作为疾病严重性的评估依据。该病延长患儿平均住院日,导致严重的社会及经济问题,因此怎样预防该病的发生、降低其发病率、减少并发症、减轻住院费用、提高新生儿健康水平是深入研究该病的首要目的。支气管肺发育不良确切的病因及发病机制仍不十分明确,目前认为主要是在遗传易感性基础上,氧化应激、气压伤、容量伤、宫内感染、炎症反应等各种不利因素共同作用于发育不良的肺组织导致的肺损伤及损伤后肺组织的异常修复的结果。由于早产儿抗氧化系统发育不成熟加上氧疗产生的各种气压伤容量伤以及由于高氧毒性产生的自由基、活性氧(ROS)都在细胞分子层面(如蛋白、脂类、碳水化合物、DNA等)对发育中的肺产生了损害从而促进细胞的死亡。研究发现,早产儿吸入高浓度氧或长期机械通气时,肺组织大量的氧自由基及炎性介质的产生,引起炎性细胞在肺内聚集,活化的中性粒细胞及巨噬细胞又释放氧自由基从而加剧肺损伤,最终导致BPD的发生。可见,氧化应激及其诱发的炎症反应在BPD的发生发展中发挥了至关重要的作用。该病目前尚无确切有效的治疗措施。大量研究表明类固醇能通过抑制炎性反应保护BPD患儿的肺功能,然而其严重的副作用(如胃肠道出血、穿孔、高血压、高血糖)抑制了固醇类药物的使用。近年来,随着机械通气技术的改进及肺表面活性物质的广泛应用,早产儿的存活率明显增加,我国BPD的发病率也呈逐年上升趋势。表皮生长因子样结构域7(EGFL7)是血管内皮细胞分泌的一种蛋白,对血管生成起着关键性作用,在肺、心脏、肾脏表达很高,Dong Xu等研究表明EGFL7与内皮细胞死亡及高氧所致肺损伤密切相关,暴露于高氧的新生鼠肺中EGFL7基因表达显著下降。因此,抑制EGFL7下调将有益于BPD的治疗。抗氧化治疗可作为预防和治疗BPD的潜在手段。近年来,黄芪多糖(APS)在多种急慢性疾病中突出的抗氧化抗炎作用引起了人们的关注。R. CHEN等研究显示APS可通过降低丙二醛(MDA)浓度、提高超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性清除氧自由基从而降低氧化损伤。另外APS作为良好的抗氧化剂,能有效的抑制氧自由基的生成,阻止其作用于膜脂质过氧化物,减少生物膜的损伤在改善缺氧及防止再灌注性肺损伤中发挥了重要的保护作用。而在高氧诱导的新生儿肺损伤中APS所发挥的保护性作用,目前知之甚少。我们假设在高氧诱导的肺损伤中,APS能够通过上调EGFL7来阻断血管内皮细胞的死亡及促进血管发育及功能成熟,阻断NF-κB信号通路,抑制NF-κBp65及相关炎症因子的产生从而对BPD起到保护性作用。本实验拟采用密闭容器中通70%-85%高氧制作新生鼠BPD模型,观察应用黄芪多糖干预后的BPD模型SD新生鼠肺组织的病理学变化,相关氧化、炎性因子、血管生成因子蛋白及基因表达以探讨黄芪多糖对BPD的治疗作用。研究目的1、证实APS能够通过上调EGFL7、Bcl-2,下调Bax表达来降低血管内皮细胞调亡,促进血管发育及功能成熟从而起到保护性作用;2、探讨APS抗氧化的机制及通过阻断NF-κB信号通路的抗炎机制,在分子水平上寻找APS的作用靶点,证实APS通过抗氧化及抗炎作用可以有效防治BPD的发生发展,为临床应用APS防治BPD提供理论依据。研究方法1、BPD动物模型的建立：将144只SD新生鼠随机分成6组(n=24)：空白对照组(Control group)、空气+低剂量黄芪多糖处理组(20mg/kg.d)(RA plus LD APS group)、空气+高剂量黄芪多糖组(40mg/kg.d)(RA plus HD APS group)、BPD模型组(BPD group)、高氧+低剂量黄芪多糖组(LD APS group)、高氧+高剂量黄芪多糖组(HD APS group);采用密闭容器通70%-85%氧建立新生鼠BPD模型。2、分别于小鼠生后4天、10天、14天取肺组织应用HE染色方法观察各实验组鼠肺组织病理学变化及检测,采用图像分析系统定量测定肺泡平均截距(LM)、平均肺泡数(MAN)；3、应用相应试剂盒检测各实验组中SOD活性及MDA浓度；4、计数各时间点小鼠肺泡灌洗液(BALF)中肺泡巨噬细胞及中性粒细胞数；5、Real-Time PCR方法检测各实验组肺组织中EGFL7、Bax、Bcl-2、NF-κBp65,CD31,ICAM-1及TNF-α基因表达水平；6、免疫组化法检测TNF-α和CD31蛋白表达水平,同时计算肺组织血管密度；7、Western blot方法检测各实验组肺组织中EGFL7、Bax、Bcl-2、NF-κBp65及ICAM-1蛋白表达水平；8、实验数据均以X±SD表示,应用SPSS13.0对数据进行分析,各组间比较采用单因素方差分析或析因分析,同时间点两两比较采用t检验,检验水准a=0.05。结果1、BPD模型组与对照组相比肺泡数目减少、体积增大、肺泡结构化简单、肺微血管数目减少形态异常、肺泡周围及间质有大量的炎性细胞浸润,黄芪多糖处理组新生鼠肺组织损伤明显较BPD模型组轻；2、与BPD模型组相比,各时间点APS组MLI显著减少,单位面积内的MAN显著增加((p<0.05or p<0.01);3、同对照组相比,在14天时BPD组SOD活性显著降低,MDA浓度显著升高,而RA+APS组较BPD模型组而言,各时间点其SOD活性均显著升高、MDA浓度均显著降低；而这一结果在LD+APS组仅出现在10天时；空气对照组与空气+APS组在各时间点均无统计学差异；4、同对照组相比,BPD模型组支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞及巨噬细胞的数在各个时间点均升高(p<0.01),而APS组中性粒细胞及巨噬细胞的数量则较BPD组显著降低(p<0.05或p<0.01)。空气对照组与空气+APS组在各时间点均无统计学差异5、与对照组相比,BPD模型组EGFL7、Bcl-2、CD31基因及蛋白水平降低,NF-κBp65, ICAM-1、Bax和TNF-α基因及蛋白水平升高(p<0.05or p<0.01)；APS干预组NF-κBp65、ICAM-1、Bax及TNF-α基因及蛋白表达水平各时间点均较BPD组降低,而EGFL7、Bcl-2、CD31基因及蛋白水平较BPD组升高,且存在剂量依赖性,最佳剂量为高剂量组。空气对照组与空气+APS组在各个时间点各检测指标均无显著差异。结论1、APS可增加BPD模型鼠肺内SOD活力、降低MDA水平,从而清除BPD模型鼠肺内氧化应激产生的ROS,达到抗氧化作用,保护细胞免受氧化应激损伤；从抗氧化层面起到保护BPD的作用；2、APS可通过上调EGFL7、CD31基因或蛋白表达减少支气管肺发育不良气道重塑,减轻BPD肺血管发育受阻,促进BPD模型鼠肺血管发育,减轻肺泡损伤,从减轻BPD肺血管发育受阻层面起到保护BPD的作用；3、APS可通过上调BCL-2、降低BAX基因及蛋白表达水平,减轻BPD肺细胞凋亡,从协助EGFL7减轻BPD肺血管发育及减少BPD肺细胞不当凋亡层面气道保护BPD的作用；4、APS可通过下调NF-κBp65、TNF-α及ICAM-1基因及蛋白表达水平；减轻BPD鼠模型肺泡灌洗液中中性粒细胞及巨噬细胞的数目,减轻炎症发生,从抗炎层面起到保护BPD肺发育的作用；5、本实验从分子层面探讨了APS对BPD的作用,APS降低氧自由基下调免疫炎症应答系统的部分促炎症因子及粘附分子,如TNF-α, NF-κBp65, ICAM-1,一定程度上减轻BPD肺血管发育受阻,减少BPD肺细胞凋亡,这对从分子层面干预BPD病情进展及预防治疗BPD提供了很好的依据。6、总之,APS减少支气管肺发育不良气道重塑,减轻肺泡损伤,对支气管肺发育不良有保护作用,可作为治疗支气管肺发育不良潜在药物。