亚硝酸盐虽然在食品行业中具有护色和防腐的作用,但人体摄入过量的亚硝酸盐就会产生致畸致癌的危害,因此寻求一条可行的降解亚硝酸盐的途径一直是国内外研究的热点。目前,降解食品中亚硝酸盐的方法主要有化学方法和生物方法,其中利用亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,简称NiR)降解食品中的亚硝酸盐是一条有效的途径,该酶广泛存在于植物或微生物中,而目前利用基因克隆技术从中获得NiR酶的报道却很少。本研究利用基因克隆技术将nir基因克隆至原核表达载体中,经诱导后高效表达。此技术对生产酶制剂及将该酶用于工业化生产奠定了基础,具有广泛的应用前景。具体研究内容如下:1.以木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种的总DNA为模板,根据Genbank中NiR的基因序列设计引物,利用PCR技术扩增出与预期大小相符的条带,大小为1083bp,将扩增产物与T载体连接,构建重组质粒pMD18-T-nir并测序,测序结果与Genbank中序列比对,同源性为98.43%。对pMD18-T-nir质粒和表达载体pET-28a(+)酶切,将酶切产物转化到感受态细胞中,成功构建了 pET-28a-nir。2.将重组质粒pET-28a-nir转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,即BL21/pET-28a-nir,以终浓度为0.6mmol/L的IPTG 30℃诱导表达5h,经诱导表达出37KDa目的蛋白条带,对重组酶进行可溶性分析,结果表明该酶为胞内酶,大部分形成包涵体,细胞破碎提取粗酶液,对粗酶的酶学特性进行初步分析,结果表明该酶的最适pH值为6.5,最适温度为35℃,在此条件下测得粗酶活力为51.74 U/mL。3.对细胞发酵液超声破碎冷冻离心后取包涵体,用透析方法对包涵体变性溶解及复性,复性液经冷冻干燥及过滤处理,用体积为1mL的Ni-NTA柱对蛋白纯化,最终测得蛋白浓度为0.06mg/mL,纯酶活力为13.04U/mL。