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目的骨形成(由成骨细胞介导)与骨吸收(由破骨细胞介导)之间的平衡对于维持骨骼健康有着至关重要的作用。当破骨细胞活动过度激活时(骨代谢失去平衡),可导致一系列溶骨性疾病。因此,寻找可抑制异常破骨细胞形成或调控异常破骨细胞功能的新型小分子药物,对于治疗骨溶解性疾病有着至关重要的作用。本研究旨在探究中药单体牡荆素对于破骨细胞分化的作用,并通过动物实验研究牡荆素在治疗破骨细胞相关性骨溶解性疾病中的作用。方法从6周雄性C57小鼠中提取原代骨髓巨噬细胞(BMMs),并使用核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等细胞因子体外诱导BMM细胞分化形成破骨细胞。通过CCK-8实验评估不同浓度牡荆素对于BMM细胞的毒性作用,以确定合适的体外药物使用浓度。在BMM细胞分化过程中,加入不同浓度的牡荆素进行干预,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测破骨细胞的形成情况(TRAP染色阳性且具有3个以上细胞核的细胞定义为破骨细胞)。通过F-actin环染色实验和骨片吸收实验进一步检测牡荆素对于破骨细胞骨吸收能力的影响,分析不同浓度牡荆素对于F-actin环形成及骨片表面骨吸收陷窝形成的作用。使用实时荧光定量PCR测定Acp5、Ctsk、Fos、Nfatc1、Dcstamp、Atp6v0d2等破骨细胞分化过程中特异性表达的基因。通过蛋白电泳技术来检测牡荆素对于MAPKs、NF-κB等信号通路的影响,探究其潜在的分子机制。最后,本实验构建了脂多糖(LPS)诱导的小鼠颅骨骨溶解模型,根据动物实验分组(假手术组,LPS组,LPS+5mg/kg牡荆素组,LPS+15mg/kg牡荆素组),连续1周颅骨表面局部注射相应溶液。收集各组小鼠颅骨标本,放置于4%福尔马林溶液中固定3天后,标本用于Micro-CT扫描分析和组织切片染色。结果在体外实验中,使用牡荆素浓度为0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100μM的培养基培养BMM细胞48小时和96小时,CCK-8实验结果显示,50 μM及以下浓度的牡荆素对于细胞没有明显的毒性作用,而100μM牡荆素显著抑制BMM细胞增殖。在BMM细胞分化过程中,加入不同浓度的牡荆素(0、12.5、25、50 μM)进行干预,TRAP染色显示,与对照组相比,各加药组的破骨细胞形成均减少,且随药物浓度增加,破骨细胞数量愈少。此外,在破骨细胞分化中晚期(Day2-Day4或者Day4-Day6)给予50 牡荆素处理后,破骨细胞分化受抑制;在破骨细胞分化早期(Day0-Day2)使用牡荆素干预对破骨细胞分化无明显影响。本实验进一步检测了牡荆素对破骨细胞骨吸收功能的影响。在BMM细胞分化过程中,加入不同浓度的牡荆素进行干预,F-actin环染色结果显示,与对照组相比,各加药组破骨细胞F-actin环相对较少;骨片扫描电镜结果显示,对照组骨片上出现大量骨吸收陷窝,而各加药组骨片骨吸收陷窝明显减少;实时荧光定量PCR 结果显示,对照组细胞 Acp5、Ctsk、Fos、Nfatc 1、Dcstamp、Atp6v0d2 等基因的mRNA表达水平明显升高,但在各加药组中,这些基因的表达水平均下降。此外,蛋白印迹结果显示,在RNAKL的刺激下,p38和ERK磷酸化水平在5分钟时开始升高,15分钟时达到最高峰,随后逐渐回复至正常,而在加药组中(50 μM牡荆素),p38和ERK的磷酸化水平明显减弱。在破骨细胞分化过程中,c-Fos和NFATc1的表达量逐渐上升,并于第3天达高峰。当使用50 牡荆素干预后,c-Fos和NFATc1的表达量均明显下降。在体内实验中,Micro-CT结果显示,与假手术组相比,LPS造模组小鼠颅骨骨量/组织体积(BV/TV)降低,小鼠颅骨孔隙数量和小鼠颅骨孔隙率增加;与LPS组相比,牡荆素加药组小鼠颅骨骨量/组织体积(BV/TV)上升,小鼠颅骨孔隙数量和小鼠颅骨孔隙率均降低,其中高剂量组效果更显著。组织切片染色显示,LPS组较假手术组颅骨骨小梁表面有更多破骨细胞形成;与LPS相比,牡荆素加药组小鼠颅骨骨小梁表面破骨细胞形成明显减少,且高剂量组破骨细胞数量更少。结论1、牡荆素可抑制破骨细胞分化。2、牡荆素可通过抑制ERK/p38/c-Fos/NFATc1信号通路抑制破骨细胞形成。3、牡荆素可挽救脂多糖诱导的小鼠颅骨骨量丢失。