化学生物学是一门用新颖的化学方法来阐释和操纵生物系统,研究生物学现象,解决现实世界中的生物学问题的学科。近十年来,化学生物学得到长足的发展,其影响已经拓宽到了更广泛的学科领域。中药的化学生物学将传统的基于结构的中药化学成分研究,引入到“生物学活性”研究的新层面,在分子靶标和作用机制的基础上,阐释有效成分的核心结构与其靶标蛋白的作用关系。然而中药药效成分的体内吸收、代谢和分布等具有复杂性,通常其在体内又具有“多重靶点”的特性,这就给中药的化学生物学研究带来了很大的挑战。为了建立中药药效成分的化学生物学研究平台,本论文分别选择了牛蒡苷元和甘草次酸作为实例,展开了作用靶点确证和代谢分布的化学生物学研究。本论文首先采用悬浮聚合技术制备了聚乙烯醇磁性微球,开展了基于点击化学反应捕获靶标蛋白的磁性捕获技术的研究。一方面以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,采用荧光素以及叠氮对其进行了双标记；另一方面通过逐步反应将磁球的端位引入了炔基基团,中间修饰了二硫键结构；使得该磁球可以基于点击化学的方法特异性的捕获叠氮修饰的BSA,又可以通过还原二硫键而将捕获蛋白解离下来。以此为模型通过荧光共振能量转移的方法来检测磁球捕获的蛋白的能力,并通过响应面设计对微球的粒径和官能团覆盖度等参数进行了优化。结果显示,最佳性能磁球的粒径范围为1.25-6.31μm,官能团覆盖度范围为48.53-73.05%,其捕获蛋白能力最强,约每毫升磁球捕获67.07μg的BSA,与实际捕获量(63.92±0.18μg)非常接近,证实了模型的可靠性并可以进行特异性靶标蛋白的富集。其次,本论文利用叠氮标记的非天然糖1,3,4,6-O-乙酰N-叠氮乙酰胺(Ac4ManNAz)孵育人肺腺癌A549细胞,通过代谢标记手段产生了叠氮标记的糖蛋白,再使用上述炔基修饰的磁球对其进行捕获分离。发现1mL磁球可以分离得到51μm细胞表面糖蛋白,验证了基于点击化学方法捕获糖蛋白的可行性。在此基础上本论文制备了叠氮修饰的聚乙烯醇磁球和炔基化修饰的牛蒡苷元,通过点击化学反应,针对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)开展了捕获牛蒡苷元靶蛋白的研究。PharmMapper数据库的靶标预测结果显示,牛蒡苷元抗炎靶点可能为3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1)。经SDS-PAGE电泳和western blot分析,利用抗PDPK1抗体验证了PDPK1蛋白大量存在于所磁性捕获的蛋白中。进一步结合分子对接及分子动力学分析,证实牛蒡子苷元与已知的PDPK1抑制剂253具有相近的作用方式及作用强度,初步确认PDPK1为牛蒡子苷元的作用靶点之一,为深入研究牛蒡子苷元的作用机理打下基础。为了改善磁球捕获靶蛋白技术在组织细胞定位观测以及在蛋白捕获量上的局限性,本论文进一步又设计了一种新颖的聚赖氨酸自组装荧光纳米球,经透射电镜形态观察该微球大小均匀,粒度分析结果表明平均粒径为38nm。经酶标仪荧光检测,552nm激发波长下,其最大发射波长为596nm,荧光强度可以达到相同浓度Rhodamine溶液的两倍,提高了捕获载体的生物相容性、荧光可示踪性以及捕获分离的便捷性。进一步对其进行了叠氮功能化修饰,并通过点击化学反应与炔基牛蒡子苷元结合,制备了连接有牛蒡子苷元的荧光纳米球。将上述微球通过尾静脉注射用于急性肺炎小鼠,进行活体成像分析,发现其胸腔的浓度明显升高；离体各器官的荧光强度测定也显示,模型组小鼠肺部的荧光强度可以达到其它器官的2倍以上,证实了牛蒡子苷元的靶点主要集中在肺部。利用人支气管上皮BEAS-2B细胞开展牛蒡子苷元的细胞成像研究,发现结合有牛蒡子苷元的荧光纳米球在细胞内有结合特异性,证明牛蒡子苷元的靶点主要分布在胞浆中。利用上述合成的连接有牛蒡子苷元的聚赖氨酸荧光纳米自组装纳米球以及空白纳米球,分别对BEAS-2B细胞中的靶蛋白进行了捕获研究。经过流式细胞分析,确定了共同孵育3h为最佳的捕获时间；通过裂解细胞和超滤对捕获蛋白进行富集,并经DTT还原和超滤浓缩得到了相应的结合蛋白。SDS-PAGE电泳分析显示,阳性蛋白富集率远远高于和阴性蛋白。经HPLC-MS/MS鉴定,阳性组共鉴定出675种蛋白,阴性组为750种蛋白；使用Protein Score和Coverage软件进行条件过滤,发现其中阳性样品中有19种蛋白,阴性样品中有14种蛋白为可能的目标蛋白；进一步采用生物信息学工具String9.0和KEGG对目标蛋白的相互作用关系进行分析,最终将阳性蛋白样品划分为4个功能组,分别与能量代谢、炎症、钙调节和热休克等功能相关；而阴性样品只能划分出1个细胞骨架调节蛋白组,证明为非特异性吸附的蛋白。进一步通过AutoDock4.0软件将上述阳性蛋白与牛蒡子苷元进行分子对接,确认其可能的蛋白靶点。筛选结果表明,牛蒡子苷元对肽基脯氨酰异构酶(PPIA),热休克蛋白70(HSPA8),肌动蛋白γ1(ACTG1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)等显示出较强的结合力,结合能分别为-7.89,-7.62,-7.27和-7.22kcal/mol,并存在合理的氢键结合,证实了牛蒡子苷元的作用靶点为PPIA,HSPA8,ACTG1和GAPDH,分别与胞内钙离子、热休克抑制、炎症通路和调控能量代谢相关。最后,本论文围绕桔梗“引经报使”改变甘草的药效分子甘草次酸的动态分布过程开展化学生物学研究。分别对甘草次酸进行衍生化,制备可用于甲苯磺酰氯亲核取代进行放射性18F标记的前体衍生物,并对其18F标记条件进行探索。结果发现,通过羧基衍生的直链羟基取代后再进行亲核取代,利于18F-甘草次酸的合成,产率为16.9%,放射性强度为150mCi,放射化学纯度为98.6%。以此为基础建立了基于PET的甘草次酸药代分布研究模型,以口服桔梗总皂苷进行干预,再通过小鼠尾静脉注射18F-甘草次酸,分别对主要器官的血药浓度进行了在线活体的观测。经数据分析发现,在注射前一次性灌胃给桔梗总皂苷(50g/kg)组,从给药7min开始至115min,肺部18F-甘草次酸的浓度明显升高,为对照组的2.7倍,而其它器官没有明显的变化,印证了桔梗能够引甘草上行的观点。而在注射前一周每天灌胃给药上述相同计量的桔梗总皂苷,注射当天停止给药,同样观察药代分布变化,结果发现几乎没有改变甘草次酸药代分布的效果。因此推测,可以是药物相互作用的原因改变了甘草次酸的药代分布,具体分子机制还有待进一步研究。本论文采用了点击化学、磁性捕获、纳米自组装以及PET成像等重要的研究手段,分别对牛蒡子苷元的组织分布、细胞定位、以及靶点蛋白捕获以及桔梗引甘草上行的机制等进行了研究,初步建立了筛选和鉴定细胞内的靶点蛋白,并通过生物信息学分析、分子对接和基于结构的计算分析手段确证相应的靶标蛋白及其生物学功能,以及开展相关代谢分布研究的中药化学生物学方法,为在分子层面揭示药效分子的作用机制奠定了基础。