论文部分内容阅读
禾谷孢囊线虫严重影响禾谷类作物的产量，在小麦中由禾谷孢囊线虫引起的产量损失可达30-100％。尤其在澳大利亚、欧洲、印度和中东危害严重，目前禾谷孢囊线虫已成为危害我国作物的主要病源。控制禾谷孢囊线虫的方法主要有：作物轮作、杀线虫剂、寄主抗性等等，其中基因工程方法培育抗线虫小麦品种被认为是最经济有效的方法。分离抗禾谷类孢囊线虫基因对揭示抗性基因结构与功能及其表达调控具有重要意义。
尽管小麦是重要的粮食作物，在小麦中已发现的抗禾谷孢囊线虫的基因很少，而比其近缘属如节节麦、易变山羊草、偏凸山羊草中含有丰富的抗源。目前已鉴定出禾谷孢囊线虫抗性位点Cre，并发现了9个禾谷孢囊线虫抗性基因(Cre1，2，3，4，5，6，7，8，and R)，其中只有Cre1和Cre8直接从普通小麦中获得。从节节麦中获得的Cre3基因能最有效的控制线虫数量，其次是Crel和Cre8。这些基因的克隆对于了解禾谷孢囊线虫抗性机制及进一步的育种应用都是非常关键的。然而，目前为止仅有Cre3基因通过图位克隆的方法从节节麦中被分离得到。该基因已被克隆得到的多数线虫抗性基因一样均属于核苷酸结合位点区(NBS)-亮氨酸重复序列区(LRR)基因家族。目前，已有很多抗性基因被分离，这些已知的NBS-LRR类抗性基因的保守序列为应用PCR的方法克隆新的抗性基因提供了可能。
因此本课题的目的是采用保守区同源克隆、3RACE和5RACE等方法从抗禾谷孢囊线虫小麦-易变山羊草小片段易位系E10中克隆小麦抗禾谷孢囊线虫基因全序列，进而通过半定量PCR和荧光定量PCR研究该基因的表达模式。同时通过mRNA差别显示技术和任意引物PCR(RAP-PCR)技术分离克隆植物禾谷孢囊线虫抗性基因及其相关基因，为阐明植物抗病性分子机制以及改良作物抗病性和作物育种提供基础，为通过分子标记辅助育种和基因工程方法实现高效、定向转移抗病基因到优良小麦品种奠定了重要的理论和物质基础。主要研究结果：
1.本实验根据此前从抗禾谷孢囊线虫材料E-10扩增得到的与来自节节麦的抗禾谷孢囊线虫Cre3基因及其他的NBS-LRR类抗性基因的NBS和LRR保守区序列设计了两对特异性引物，从E10中扩增到532bp和1175bp的两个目标条带，它们有一个32bp的共同序列，连接构成总长为1675bp的NBS-LRR编码区(命名为RCCN)。根据RCCN设计引物，利用NBS-LRR区序列设计引物，通过5RACE和3RACE技术采用3-Full RACE Core Set(TaKaRa)和5-Full RACE Kit(TaKaRa)试剂盒，反转录后通过嵌套引物GSP1和GSP2分别进行两轮基因特异性扩增，分别将NBS_LRR区向5端和3端延伸了1173bp和449bp，并包含了起始密码子和终止密码子。根据拼接的得到的序列重新设计引物扩增进行全基因扩增的结果与上面获得的一致。拼接后得到全长2775 bp的基因序列(记作CreZ，GenBank号：EU327996)。CreZ基因包括完整的开放阅读框，全长2775 bp，编码924个氨基酸。序列分析表明它与已知的禾谷孢囊线虫抗性基因Cre3的一致性很高，并且它与已经报到的NBS-LRR类疾病抗性基因有着相同的保守结构域。推测CreZ基因可能是一个新的NBS-LRR类禾谷孢囊线虫抗性基因，该基因的获得为通过基因工程途径培育抗禾谷孢囊线虫小麦新品种奠定了基础，并为抗禾谷孢囊线虫基因的调控表达研究提供了参考。
2.通过半定量PCR和SYBR Green荧光定量PCR技术对CreZ基因的相对表达模式进行了研究。以α-tubulin2作为参照，采用半定量PCR分析CreZ基因在不同接种时期1d，5d，10，15d的E-10的根和叶的的表达情况。在内参扩增一致的条件下，CreZ在E-10的根部随着侵染时间的增加表达量有明显的增加，在没有侵染的E-10的根部其表达量没有明显变化，而在叶中没有检测表达，说明该基因只在抗性材料的根部表达。SYBR Green定量PCR分析接种前后E10根部基因CreZ基因的表达水平为检测CreZ基因的表达建立了一套灵敏、可靠的SYBRGreen I荧光定量PCR检测方法。接种禾谷孢囊线虫后E10根内CreZ基因的相对表达水平显著高于接种前。随接种时间的延长持续增加，最终CreZ基因的相对表达量达到未接种的对照植株的10.95倍。小麦禾谷孢囊线虫抗性基因CreZ的表达量与胁迫呈正相关，表明其与小麦的的禾谷孢囊线虫抗性密切相关，推测CreZ基因可能是一个新的禾谷孢囊线虫候选抗性基因。
3.针对小麦基因组庞大、重复序列较多，禾谷孢囊线虫抗性基因及其相关基因的片断难以有效克隆的问题，通过mRNA差别显示技术及RAP-PCR技术分离克隆植物禾谷孢囊线虫抗性及其相关基因。试验最终得到154条差异表达条带，将回收得到的差异条带的二次PCR扩增产物经纯化后点到带正电的尼龙膜上，进行反向Northem杂交筛选，最终筛选得到102个阳性差异点。将其中81个进行测序，并将序列提交到Genbank中的dbEST数据库，分别获得登录号(FE192210-FE192265，FE193048- FE193074)。序列比对分析发现，其中26个序列与已知功能的基因序列同源；有28条EST序列在已有核酸数据库中未找到同源已知基因和EST，属新的ESTs序列；另外27个EST序列与已知核酸数据库中的ESTs具有一定相似性，但功能未知。其所得ESTs序列补充了Genbank ESTs数据库，为今后进一步开展抗禾谷类孢囊线虫基因研究工作打下了基础。结合本试验功能基因的相关信息，对小麦接种禾谷孢囊线虫后产生的抗性机制进行了探讨。接种禾谷孢囊线虫后植物在mRNA水平上的应答是相当复杂的，同时植物的抗病机制是一个复杂的过程，涉及到多个代谢途径的相互作用。