背景传统观点认为,成年个体中枢神经系统(cenctral nerve system, CNS)损伤后不能进行具有实质意义的再生和形成功能性突触联系,往往导致损伤后永久性神经功能缺失,给病人、家属以及整个社会带来长期的损失,所以CNS损伤后修复与再生是神经科学研究的一个重要课题。随着医学科学和技术的不断发展进步,利用干细胞(stem cell)移植治疗CNS损伤展现出了良好的应用前景。干细胞是指具有多种分化潜能和自我更新能力的细胞,这种细胞存在于成年个体的多种组织中或者胚胎中。近年来,随着干细胞研究的不断发展,骨髓间充质干细胞(bone marrow Mesenchymal stem cells, BMSCs)成为干细胞治疗应用研究领域的关注焦点BMSCs是一种源自成年个体骨髓的干细胞,具有多种分化潜能,可诱导分化为神经元样细胞,同时还具有增殖能力强、取材方便、无自身免疫排斥反应、自体移植避免伦理道德问题等优势。因此,BMSCs可作为是一种良好的种子细胞应用于细胞移植治疗。前期实验研究已经在动物模型中利用BMSCs治疗CNS损伤,如脑外伤,脑卒中,以及脊髓损伤等。这些研究结果表明,移植的干细胞对CNS损伤修复呈有乐观疗效。例如,干细胞可促进神经功能恢复,降低脑组织细胞凋亡率,促进内源性神经再生,改善血管,降低病灶体积等。至于其发挥作用的机制,现观点认为,除了分泌营养因子之外,移植的BMSCs有可能迁移到受损伤的组织并分化和替换受损神经细胞；也可能参与机体免疫/炎性过程的调节,但相关证据尚不充分。基于以上几点,本实验前期曾以“锰离子增强磁共振(manganese enhanced magnetic resonance imaging, MEMRI)追踪骨髓源神经干细胞(BMSCs-derived neural stem cells, BMSCs-D-NSC)移植后与宿主脑组织功能重建”为出发点,初步探讨了MEMRI条件下,是否能有效追踪移植干细胞与宿主组织之间的结构整合,但实验过程中遇到了未知的细胞活力状态与MEMRI条件限制,故后期研究(即本课题主要关注点)从“BMSCs是否参与机体免疫/炎症调控过程”的角度再对BMSCs移植疗效机制进行了探讨,重点关注了"BMSCs抑制小胶质细胞激活机制”并获得有意义数据。具体言之,在前期以MEMRI追踪待移植BMSCs-D-NSCs是否与宿主脑组织功能实验中,我们重点考虑的是在评估干细胞治疗效果的基础上,采用无毒、无创、并可进行活体观察的MEMRI方法对BMSCs-D-NSCs疗效机制进行功能性追踪评估。已知磁共振成像(MRI)具有较好的成像分辨率且具无创性,近年常被用于研究生物体内部结构或评估动物实验疗效等；最近,又有越来越多的研究利用锰离子(Mn2+)作为造影剂来研究机体各系统尤其是CNS的结构及功能。锰离子作为一种顺磁性物质,可以缩短其周围水质子的弛豫时间、从而增强磁共振T1加权像的信号强度(SI)。与其它造影剂相比,锰具有以下潜在优点：1、作为钙离子(Ga2+)类似物,锰离子可以通过电压门控钙通道迅速进入神经细胞,之后一部分离子还可通过微管运输并穿越突触到达突触后神经元,为追踪神经元之间的突触功能提供了可能。2、由于其低清除率的特点,可以在应用造影剂后有充足的时间进行MEMRI,以获得较高分辨率和高信噪比的图像,为研究机体解剖结构和功能提供了条件。但是,制约锰离子在生物研究中应用的主要问题是其具有神经毒性。目前,还没有建立既能进行MEMRI成像,而又不引起的细胞毒性的最佳锰离子使用条件。本课题的这部分研究旨在以体外实验探索无神经细胞毒性的最低成像浓度,以达到既不影响神经元的各种生物学特性、又能有效标记神经元的目的。通过本部分实验结果我们发现,虽然锰离子是一种良好的造影剂,可用于神经细胞成像,但当达到可成像剂量时其对神经元的毒性也非常显著,同时由于实验条件所限(目前拥有的MRI分辨率尚难达到细胞分子及突触水平),故调整了“追踪所移植BMSCs与宿主组织细胞进行结构与功能整合的疗效机制”研究思路,从BMSCs参与调控免疫/炎症过程发挥疗效机制的角度进行了后续研究。而MEMRI追踪BMSCs疗效机制的研究有待未来进一步完善。如前所述,随后的课题从“BMSCs是否参与机体免疫/炎症调控过程”的角度再对BMSCs移植疗效机制进行了探讨,并重点关注了"BMSC s 抑制小胶质细胞激活机制”。本课题组前期研究结果发现,干细胞可在脑外伤(TBI)模型中调节脑组织炎症反应,如调节炎症相关的细胞因子释放和脑组织中免疫细胞活化,并且BMSCs发挥有益作用的机制可能与上调肿瘤坏死因子α-刺激基因-6(tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6, TSG-6)蛋白、从而抑制核因子κB(nuclear factor, NF-κB)信号同路有关。然而,TSG-6是否通过直接影响CNS内主要的免疫炎症细胞,既小胶质细胞的活化反应从而发挥抗炎,促进神经恢复的作用仍不清楚。由此,本课题考虑,移植的BMSCs是否通过对小胶质细胞的影响来调控上述的这种免疫/炎性过程、从而发挥相关疗效?如果答案是肯定的,那么BMSCs是如何影响了小胶质细胞并引发后续的一系列效应?小胶质细胞,相当于脑和脊髓中的巨噬细胞,是CNS中的第一道也是最主要的一道免疫防线。作为CNS中的免疫细胞,在CNS的免疫监视和内环境平衡的维持中发挥有关键作用。许多病理条件见下,如脑损伤,全身性感染,以及帕金森病(parkinson’s disease, PD)、多发性硬化(multiple sclerosis, MS)和阿兹海默症(Alzheimer’s disease, AD)等慢性疾病,有时甚至是非常微弱刺激作用下,即可引起小胶质细胞过度活化；而小胶质细胞活化后可释放多种炎症介质,如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素1(interleukin 1,IL-1)、白介素6(IL-6)、干扰素γ (interferony, INF-γ),细胞毒性物质如一氧化氮(netric oxide, NO)、活性氧(reactive oxygen, ROS)等,从而引起脑的炎症反应。最近许多研究表明,神经损伤的主要原因是小胶质细胞过度活化引起的炎症反应,而并非直接的神经损伤,激活的小胶质细胞在神经创伤及神经炎症性疾病的发病机理中起有十分重要的作用。因此,调节小胶质细胞过度活化引起的炎症反应对治疗CNS损伤可能是一种非常有应用前景的新途径。国外已有部分学者研究BMSCs对小胶质细胞的功能的影响。Debora等发现BMSCs可以通过分泌CX3C L1蛋白(一种趋化因子)使小胶质细胞从促炎状态变为神经保护状态。Zhou等发现BMSCs可以抑制BV2小胶质细胞系受脂多糖(LPS)刺激后的NO产生。而Rahmat等研究则发现,BMSCs能促进BV2细胞NO和IL6的产生,并减少TNFa的产生。但BMSC s对小胶质细胞的作用机制尚不完全清楚。本课题在前期实验结果基础上,继续深入研究BMSCs对CNS损伤疗效机制,以BMSCs分泌的TSG-6为研究重点,探讨其是否对小胶质细胞的激活有调节作用,以及其发挥作用的可能机制。为BMSCs治疗CNS损伤提供实验依据和新思路。第一章用于神经细胞成像的锰离子最适条件探索目的拟利用锰增强磁共振成像(MEMRI)技术,从移植细胞与宿主神经细胞突触形成及功能活动的显像角度,探讨BMSCs移植治疗CNS损伤的疗效机制。首先确定锰离子是否可以在对皮层神经元无毒条件下显著提高皮层神经元的磁共振信号强度。方法原代Wistar大鼠皮层神经元培养。当细胞生长到第7天时,神经元用不同浓度的氯化锰处理：分别为对照组、0.01、0.05、0.10、和0.20mMo1/L组；然后消化细胞进行MRI检查,通过ICP-MS分析细胞内的锰离子含量。不同实验组在以锰处理24小时后,再以细胞计数法(cell counting kit, CCK-8)检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放实验测定细胞毒性,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,原位末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)染色法测定细胞凋亡。结果与对照组相比,0.01mMol/L浓度锰处理的神经元在MEMRI上没有显著信号增强。当锰离子处理浓度大于等于0.05mMol/L时,神经元信号强度显著提高,分别为：对照组133.00±18.52；0.01mMol/L锰处理组194.00±30.32：0.05mMol/L锰处理组313.67±54.37；0.1mMol/L锰处理组466.67±51.94；以及0.2mMol/L锰处理组658.33±110.56。但与此同时,当锰离子处理浓度大于等于0.05mMol/L时,其对细胞活性影响也非常明显。与对照组相比,0.05mMol/L、0.10 mMol/L和0.20 mMol/L锰处理组的细胞活力分别为68.30±7.97%、54.98±9.08%和41.52±4.36%。各组培养上清中的LDH水平分别是对照组的2.04倍、2.80倍和4.99倍。细胞内ROS的形成显著增加,0.05mMol/L、0.10mMol/L 和 0.20 mMol/L锰处理组神经细胞内ROS水平分别是对照组的1.83倍,2.38倍和3.24倍。TUNEL细胞凋亡实验提示：0.01mMol/L锰处理组与对照组相比无统计学差异,对照组为8.15±1.43%,0.01mMol/L锰处理组为9.244±0.73%；0.05、0.10和0.20mMol/L锰处理组则随着锰离子浓度增高,神经元凋亡率也逐渐增高。细胞凋亡率在0.05mMol/L锰处理组为18.15±0.81%,0.10mMol/L锰处理组为23.63±0.86%,和0.20mMol/L锰处理组为35.26±3.54%。结论当锰离子处理浓度大于等于0.05mMol/L,可以显著提高神经元MRI的信号强度,但这种浓度对细胞毒性作用也非常显著。以上实验结果结合MEMRI目前难以达到细胞分子水平显像的现状,本课题暂没有再深入进行BMSCs与宿主形成突触、完成功能整合方面的MEMRI追踪研究,但的确“BMSCs与宿主组织产生结构整合”的前期工作结果乐观,对“BMSCs与宿主神经元在产生结构整合基础上的功能整合追踪”研究仍是可探寻领域,期待未来在合适情况下、以更有利于细胞成像而又无毒无创的显影剂来代替已有的Mn2+,并期待能在更高分辨率MRI条件下再进行深入研究。后续研究中,我们仍以BMSCs功能疗效机制为关注点,从BMSCs参与调控小胶质细胞功能、进而发挥受损CNS功能修复的疗效机制角度进行了探讨。第二章BMSCs抑制脂多糖引起的小胶质细胞激活的机制研究。目的小胶质细胞是脑组织中主要的免疫活性细胞,小胶质细胞介导的炎症反应与多种神经障碍的发病机制有关。最近,许多研究表明,BMSCs可通过释放多种生物活性分子,调节炎症和免疫反应,保护CNS。本课题组前期研究结果发现,干细胞可在TBI模型中调节脑组织炎症反应,如调节炎症相关的细胞因子释放和脑组织中免疫细胞活化,并且BMSCs发挥有益作用的机制可能与上调TSG-6蛋白从而抑制NF-κB信号同路有关。然而,TSG-6是否通过直接影响CNS内主要的免疫炎症细胞,既小胶质细胞的活化反应,从而发挥抗炎、促进神经恢复的作用仍不清楚。本部分实验旨在研究BMSCs以及TSG-6对LPS激活的小胶质细胞内促炎介质的表达以及炎症反应信号传导通路的影响。方法为了研究BMSCs对小胶质细胞引起神经炎症的作用机制,我们在体外利用LPS诱导BV2小胶质细胞激活的模型。利用6孔transwell培养板来评估BMSCs或TSG-6对脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)刺激BV2细胞的作用。首先,5×105个BV2细胞培养于下腔室。实验组用LPS 100ng/mL的刺激6h,对照组不加刺激。在上室加入BMSCs (细胞数亦为5×105个)或者不同浓度的TSG-6。具体分组如下：(1)单纯LPS刺激组；(2)单纯BMSCs处理组(LPS-BMSCs组)；(3)转染TSG-6siRNA的BMSCs处理组(LPS-TSG-6 siRNA BMSCs组)；(4)转染control siRNA的BMSCs处理组(LPS-control siRNA BMSCs组)；(5)rmTSG-6 1ng/ml刺激组；(6) rmTSG-6 10ng/ml刺激组；(7)rmTSG-6 100ng/ml刺激组。以上各条件处理6小时后,对BV2小胶质细胞中的TNFα,IL1β,IL6和iNOS基因表达水平以实时定量PCR进行检测。为进一步阐明TSG-6对小胶质细胞中发挥抗炎作用的分子机制,我们分别采用了免疫荧光染色、凝胶迁移率实验以及荧光素酶报告基因实验,评估了NF-κB信号通路活性；同时以western blot评估了TSG-6对MAPK信号通路的作用。又由于LPS可通过作用于Toll样受体4(TLR4)使小胶质细胞激活,而CD44是TLR2和TLR4所介导炎症反应的负调节分子,因此,为进一步了解CD44的作用及其在调节LPS刺激的小胶质细胞功能时与TSG-6之间的关系,我们用CD44-siRNA沉默BV2细胞中CD44的表达(CD44-siRNA BV2组),并重复了上述部分实验,以明确CD44在TSG-6对小胶质细胞功能调节过程中所发挥的作用及机制。结果炎症基因的改变均表示为与阴性对照组的倍比关系。我们发现,干细胞显著抑制小胶质细胞活化后促炎因子mRNA的表达。LPS和LPS-BMSCs两组之间炎症因子表达差异分别为：TNFa,11.13±1.53/2.77±0.99,(P<0.05)；IL1β,5.70±0.56/2.28±0.17(P<0.05)；IL6,11.67±1.15/3.23±0.42(P<0.05)；和iNOS,4.73±0.23/2.47±0.40(P<0.05)。此外,不同浓度的rmTSG-6, lng/ML (P<0.05), 10ng/ML (P<0.05), 100ng/ML (P<0.05)也可以减少小胶质细胞中这些促炎介质的表达。但是,当BMSCs中TSG-6的表达被沉默时,BMSCs对小胶质细胞的影响则减弱,LPS-BMSCs与LPS-TSG-6 siRNA BMSCs两组TNFa (P <0.05), ILlβ (P<0.05), IL6 (P<0.05) 和 iNOS (P<0.05)相对表达分别为：2.97±0.99/6.01±0.32(P<0.05)；2.28±0.17/4.02±0.26(P<0.05),3.23±0.42/7.68±1.14(P<0.05),2.47±0.40/3.55±0.37(P<0.05)。研究炎症相关信号通路时,我们发现TSG-6可显著抑制LPS刺激后BV2细胞中NF-κB转录活性(P<0.05)以及MAPK通路中ERK, P38, JNK的磷酸化水平。为探讨BMSCs或rmTSG-6是否通过CD44发挥作用,首先利用siRNA沉默BV2细胞中CD44表达；当CD44表达受抑制后,BMSCs或rmTSG-6对BV2小胶质细胞内炎症因子TNF-α(BV2细胞/转染CD44siRNA BV2细胞,BMSCs处理组为：3.43±0.50/8.27±0.35, P<0.05; rmTSG-6处理组为:5.48±0.87/12.33±0.87,P<0.05)和IL-1β(BV2细胞/转染CD44siRNA BV2细胞,BMSCs处理组为：2.63±0.32/3.93±0.35, P<0.05; rmTSG-6处理组为：2.82±0.66/6.33±0.25,P<0.05)表达的抑制作用减弱。当BV2细胞中CD44表达受抑制后,BMSCs或rmTSG-6对BV2小胶质细胞内NF-κB转录活性的抑制作用明显降低(P<0.05)。同样地,Western blotting对MAPK信号通路的检测结果表明,与对照BV2细胞中相比,BMSCs或nmTSG-6对转染CD44-siRNA的BV2细胞的ERK、P38和JNK蛋白磷酸化抑制作用显著降低。结论本研究结果表明,干细胞可以通过释放TSG-6来调节小胶质细胞的功能。BMSCs和TSG-6通过小胶质细胞上的CD44受体而抑制炎症基因的表达和炎症相关信号通路NF-κB、MAPK的激活。BMSCs对小胶质细胞免疫调节作用的新机制,提示可考虑将干细胞及TSG-6作为脑外伤或神经炎性疾病治疗的新途径。