研究背景与目的：实验室以往曾研究证明，由四个相似的?-三叶草结构域构成，整体呈球形结构特征的细胞微丝骨架捆绑蛋白Fascin，在食管癌组织细胞中显著异常高表达，与食管癌患者的不良预后正相关，在促进癌细胞分裂增殖与侵袭移动中发挥功能，是食管癌重要功能蛋白，但其分子作用机制如何尚不甚明了。基于此，针对Fascin蛋白存在多个磷酸化和乙酰化等蛋白翻译后修饰位点，在食管癌中可能存在蛋白翻译后修饰异常情况，导致Fascin蛋白修饰状态失衡，对Fascin蛋白的生物学活性发挥关键调控作用，在本文中选择Fascin蛋白不同结构域上的磷酸化或乙酰化修饰位点，共5个，围绕着这些磷酸化或乙酰化修饰在食管癌中，究竟有何功能，以及分子作用机制如何等重要科学问题，进行了深入系统研究，为证明我们所提出的“Fascin蛋白磷酸化与乙酰化修饰失衡促食管癌发生发展”新科学假说提供有力实验证据支持。　　实验方法：通过定点突变技术，对Fascin蛋白的Y23、S38、S39、S274和K471等不同结构域上的关键氨基酸残基位点，进行单一或双位点联合突变，模拟磷酸化与非磷酸化（Y/S→D与Y/S→A），或乙酰化与非乙酰化（K→Q与K→R）修饰，构建相应的突变型Fascin蛋白质粒表达载体，转染食管癌细胞，建立适宜细胞模型。在此基础上，再通过综合运用活细胞成像、免疫荧光和G-Actin/F-Actin结合检测等实验技术方法，同时结合系列细胞功能实验、RNA干扰和Western blotting，以及裸鼠移殖瘤实验，在分子、细胞和实验动物等三个层面，对Fascin蛋白的上述位点的磷酸化或乙酰化修饰，在食管癌中的功能与分子作用机制进行了系统研究探讨。　　实验结果：　　1）首先，针对Fascin蛋白的Y23和S274，采取单一位点模拟磷酸化与非磷酸化修饰，结果表明，无论是Y23，还是S274，虽然处于Fascin蛋白的两个不同的结构域（分别在第一和第三结构域），但是两个位点模拟磷酸化修饰却显示出相同或相似的生物学功能抑制效果，伴随着细胞的丝状伪足形成明显减少，食管癌细胞的克隆形成、分裂增殖与移动能力均显著降低；而模拟非磷酸化修饰，情形刚好相反，显示明显的生物学功能增强效果。　　2）其次，针对Fascin蛋白的S38和S39位点，采取双位点联合突变模式，模拟磷酸化与非磷酸化修饰。实验结果表明，S38和S39，任意单一位点磷酸化修饰，均表现出足够强大的抑制功能，伴随着细胞的丝状伪足的数量明显变少，长度明显变短，食管癌细胞的克隆形成、分裂增殖与移动能力均显著降低；然而，S38和S39两个位点同时模拟磷酸化修饰，并未表现出明显的抑制功能叠加效应，暗示着S38或S39，单一位点的磷酸化修饰就足以抑制Fascin蛋白的功能，可能仅需一次磷酸化修饰就达到了对Fascin蛋白抑制效能的100％，这十分符合在实际的组织细胞微环境下， Fascin蛋白迅速发生磷酸化修饰，以满足其快速应答细胞功能变化的需要。与此同时，对S38和S39双位点进行模拟非磷酸化修饰，对食管癌细胞克隆形成、分裂增殖与运动能力，显示出显著的协同促进功能，而且功能叠加效应明显；与此相对应，相比较而言，癌细胞丝状伪足的数量变得最多，长度变得最长；这从相反的角度，同样说明磷酸化修饰对Fascin蛋白的功能有非常大的影响，显示显著的负性调控功能。　　3）再次，免疫共沉淀、免疫荧光和免疫组织化学实验结果一致说明，食管癌组织细胞中，Fascin蛋白K471氨基酸残基位点乙酰化修饰真实存在。在此基础之上，对该K471位点进行模拟乙酰化与非乙酰化修饰突变，结果表明，敲降内源性Fascin表达后，再回复带标签的通过突变模拟K471位点乙酰化修饰的Fascin的表达，食管癌细胞的增殖与移动能力同样明显下降，同时食管癌细胞裸鼠成瘤与局部转移能力也同样明显下降；而G-Actin/F-Actin结合检测与活细胞成像实验结果表明，食管癌细胞中，K471位点突变模拟乙酰化修饰，可使Fascin蛋白与F-Actin的结合能力明显下降， F-actin的相对含量比例显著减少， G-actin的相对含量比例显著增加，同时细胞单位周长丝状伪足的数量明显变少，长度明显变短，细胞伸缩周期显著缩短，伸缩速率显著变慢，表现明显的抑制效果，同时使Fascin蛋白主要集中于细胞丝状伪足的根部，并且Fascin蛋白无效进出细胞丝状伪足根部区域的速率明显加快；而Fascin-K471位点突变模拟非乙酰化修饰，食管癌细胞的上述功能、行为与形态表现恰好相反，表现出显著的促进效果。　　4）最后，针对Fascin蛋白的S39和K471，采取双位点联合突变模式，分别模拟磷酸化与非磷酸化修饰，以及乙酰化与非乙酰化修饰。细胞功能实验和裸鼠移殖瘤动物实验结果表明，在敲降内源性Fascin的食管癌细胞中，回复双位点联合突变Fascin蛋白表达，Fascin蛋白S39位点突变模拟磷酸化，联合K471位点突变模拟乙酰化修饰，可协同抑制食管癌细胞的增殖、移动、裸鼠移殖瘤成瘤以及局部转移。细胞免疫荧光和G-Actin/F-Actin结合检测实验结果表明，S39位点突变模拟磷酸化修饰，联合K471位点突变模拟乙酰化修饰，可导致Fascin蛋白与F-actin的结合能力明显下降，F-actin的相对含量比例显著减少，G-actin的相对含量比例显著增加，同时细胞单位周长丝状伪足的数量更少，长度更短，细胞伸缩周期更显著缩短，伸缩速率更显著变慢，表现十分明显的协同抑制效果，同时使Fascin蛋白主要集中于细胞丝状伪足的根部，并且Fascin蛋白进出细胞丝状伪足根部区域的速率明显加快。而S39位点突变模拟非磷酸化修饰，联合K471位点突变模拟非乙酰化修饰，可使食管癌细胞的上述功能、行为与形态表现恰好相反，表现出十分显著协同促进效果。在食管癌细胞，Fascin-K471位点的乙酰化修饰与Fascin-S39位点的磷酸化修饰协同发挥作用，有主次之分；Fascin-K471位点乙酰化修饰在调控Fascin活性，进而调控食管癌细胞的功能、形态与行为上，相对而言，可能发挥着更主要作用。　　研究结论：　　1）Fascin蛋白的Y23、S38、S39和S274等位点的磷酸化修饰，均显示对食管癌细胞的抑制功能，抑制癌细胞增殖与移动，抑制癌细胞克隆形成，抑制癌细胞丝状伪足形成。　　2）概括而言，Fascin-S38和S39位点，在食管癌细胞移动、克隆形成，以及丝状伪足的形成上，模拟磷酸化修饰未见明显的协同作用，而模拟非磷酸化修饰，协同作用显著。　　3）在食管癌细胞和组织中，Fascin蛋白K471位点乙酰化修饰真实存在。　　4）在食管癌细胞中，Fascin蛋白K471位点乙酰化修饰，显著升高G-actin的相对含量比例，同时显著降低F-actin的相对含量比例，抑制Fascin蛋白捆绑F-actin，显著降低食管癌细胞的增殖与移动能力，显著抑制食管癌细胞裸鼠移殖瘤成瘤与局部转移，使食管癌细胞丝状伪足的长度明显变短，数量明显变少，伸缩周期明显缩短，伸缩速率显著变慢，与此同时，使Fascin蛋白主要集中于细胞丝状伪足的根部，并且使Fascin蛋白无效进出细胞丝状伪足根部区域的速率明显加快。　　5）在食管癌细胞中，Fascin-K471位点乙酰化修饰和S39位点磷酸化修饰，表现明显抑制性协同作用，显著抑制Fascin蛋白捆绑F-Actin，显著抑制癌细胞的增殖与移动，显著抑制癌细胞裸鼠移殖瘤成瘤与局部转移，显著抑制癌细胞丝状伪足形成，使细胞丝状伪足的长度更短，数量更少，伸缩周期更显著缩短，伸缩速率更显著变慢，与此同时，使Fascin蛋白更多集中于细胞丝状伪足的根部，并且使Fascin蛋白无效进出细胞丝状伪足根部区域的速率明显加快。　　6）食管癌细胞中，Fascin-K471位点乙酰化修饰在调控Fascin活性，进而调控食管癌细胞的功能、形态与行为上，比Fascin-S39位点磷酸化修饰，相对而言，可能发挥更主要作用。综合而言，本文研究为证明提出的“Fascin蛋白磷酸化与乙酰化修饰失衡促食管癌发生发展”新科学假说，提供了扎实实验证据支持。