【摘 要】
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β-甘露聚糖酶和内切β-1，4-葡聚糖酶是重要的工业用酶，广泛的应用于饲料业、造纸业、啤酒工业等领域。为了满足生产的要求，对工业用酶耐热耐酸高活性方面的研究日益增多。本研
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β-甘露聚糖酶和内切β-1，4-葡聚糖酶是重要的工业用酶，广泛的应用于饲料业、造纸业、啤酒工业等领域。为了满足生产的要求，对工业用酶耐热耐酸高活性方面的研究日益增多。本研究的主要目的是，从极端微生物中挖掘一些有潜在工业价值的嗜热酶，尝试利用冰岛硫化叶菌蛋白表达系统，探索这些嗜热酶在工业化应用中的可行性。本研究获得如下结果：
(1)利用PCR技术从冰岛硫化叶菌REY15A(S. islandicus Rey15A)中分别扩增得到带有和不带有信号肽编码序列的内切β-1，4-内切葡聚糖酶基因(Sis eng)，并将其克隆至硫化叶菌表达载体pZC2中，构建重组表达载体pZC2-eng-YS和pZC2-eng-WS，并转化至S.islandicus E233S(ΔpyrEFΔlacS)。重组菌株经D-阿拉伯糖诱导后，细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化，得到重组蛋白。SDS-PAGE结果表明不带有信号肽的葡聚糖酶(ENG-W)分子量为41ku，带有信号肽的分子量(ENG-SP)为43ku。酶学性质分析表明前者没有酶活性；后者酶活力为103.4U/L，最适反应温度为90℃，最适pH为4.0，耐热性实验结果表明在90℃保温60min后酶活力稳定在最高酶活力的40％以上；金属离子实验结果表明，终浓度为1mmol/L的Mn2+对重组酶促进作用最大，使其酶活力提高了约59%，终浓度为1mmol/L的Ca2+对其抑制作用最强，使其酶活力下降至43%。
(2)利用PCR技术从硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus P2)中扩增得到内切甘露聚糖酶基因，并将其分别克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a和硫化叶菌表达载体pZC2中，构建重组表达载体pET-30a-3007和pZC2-3007，并分别转化至EcoliRosetta和S.islandicus E233S(ΔpyrEFΔlacS)菌中。利用IPTG诱导重组菌株E.coli Rosetta/pET-30a-3007，SDS-PAGE检测表明目的蛋白大部分以包涵体形式存在且分子量大小为70ku，与预测一致；对其进行包涵体复性后过Ni-NTA柱纯化得到目的蛋白3007-R。重组菌株S.islandicus E233S/pZC2-3007经D-阿拉伯糖诱导后，细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化，得到重组蛋白3007-S。酶学性质分析表明重组蛋白3007-R和3007-S均没有甘露聚糖酶活性，实验结果证实在此实验条件下Sso3007不具有NCBI上预测的甘露聚糖酶活性。质谱分析重组蛋白3007-S，结果表明基因序列均全部表达。
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