三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是我国特有的淡水育珠蚌,所产珍珠占珍珠总产量的80%。已有的研究表明,基质蛋白在贝壳和珍珠的形成过程中发挥着重要作用。有关基质蛋白的研究大多都集中于海水贝类中,在淡水贝类中则相对较少。本实验从三角帆蚌贝壳珍珠层及外套膜组织中克隆得到了2个与珍珠层形成有关的基质蛋白基因,并初步研究了其在珍珠和贝壳形成过程中的作用。1.从三角帆蚌贝壳珍珠层中分离得到了一个分子量大小为22kDa的基质蛋白,根据N端测序结果和已知的基质蛋白基因MSI60的氨基酸序列AAAAAAA分别设计简并引物,从三角帆蚌外套膜中克隆得到了2个基质蛋白基因的cDNA全长序列。其中hic22基因序列全长为731bp,包含一个621bp的开放阅读框,编码206个氨基酸;hic74基因全长2882bp,包含一个2553bp的开放阅读框,编码850个氨基酸,理论分子量为73.7kDa。Hic74的氨基酸组成中富含丙氨酸(30.8%),甘氨酸(25.8%)和丝氨酸(10.6%),在丙氨酸/甘氨酸富集区中,丙氨酸主要以poly A的形式存在,并存在3个酸性区域。组织荧光定量结果显示,hic22和hic74基因在外套膜组织中特异性表达,原位杂交结果显示,hic22和hic74基因主要在外套膜的缘膜部上皮细胞表达,推测基质蛋白hic22和hic74参与了贝壳珍珠层的形成。2.在插片实验中,珍珠颗粒扫描电镜结果显示,珍珠的形成主要分为碳酸钙晶体的无序沉积和有序沉积两个阶段。在规则珍珠层还未形成之前,碳酸钙晶体无序地堆积在表面,而在珍珠层开始形成时,碳酸钙晶体首先在表面成核,然后开始有序的沉积。Hic22和hic74基因在珍珠囊形成和珍珠早期发育时期的荧光定量结果显示,在碳酸钙无序沉积阶段,hic22和hic74基因在珍珠囊中的表达水平极低,而在珍珠成核期表达水平上升,在随后珍珠层的快速生长和平稳生长过程中,两者的表达量呈逐步上升的趋势。说明基质蛋白hic22和hic74在指导碳酸钙成核、调控珍珠层生长过程中发挥着重要作用。3.在破壳修复实验观察中,贝壳先在破碎处形成角质层,而后棱柱层晶体开始在角质层的内表面堆积并快速生长,当棱柱层成熟后,珍珠层晶体开始在棱柱层堆积,且珍珠层的生长方式为典型的“砖墙型”。在贝壳修复的过程中,实验组中hic22基因表达量低于对照组,且呈逐步下降的趋势,推测基质蛋白hic22与其他基质蛋白共同参与贝壳生物矿化过程。而hic74基因则在棱柱层快速生长期和珍珠层快速生长期高表达,推测基质蛋白hic74参与了三角帆蚌贝壳棱柱层和珍珠层的矿化。