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研究背景肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤,己成为人类因癌症死亡的主要原因。非小细胞肺癌(NSCLC)占新发肺癌病例的75-80%,虽然各种治疗手段不断改善,但其预后依然很差。其主要原因在于肺癌的发病机制、特别是肺癌侵袭转移的机制尚不清楚,弄清肺癌的发病及侵袭转移机制对于预测肺癌患者的预后及提高治疗效果意义重大。Wnt5a是Wnt家族中的重要成员之一,既能活化经典的Wnt/β-catenin通路又能活化非经典的Wnt/Ca2+通路,而且Wnt/Ca2+通路与Wnt/β-catenin通路相互作用。文献报道Wnt5a与多种恶性肿瘤关系密切,在肿瘤细胞的增殖、分化及侵袭转移过程中起着重要的作用。但也有研究发现Wnt5a在不同的恶性肿瘤中生物学作用并不一致,有的认识尚存在重大分歧。部分研究认为Wnt5a具有癌基因的特性,在多种恶性肿瘤如恶性黑色素瘤、胃癌中高表达,可促进其发生及侵袭转移,Wnt5a的高表达与这些肿瘤细胞的转移潜能和患者的不良预后密切相关;而有的研究则认为Wnt5a基因具有抑癌基因的特性,可以减少或减缓如白血病、恶性淋巴瘤及结肠癌等的发生及转移。迄今国内外关于肺癌与Wnt5a的关系研究甚少,而且大多停留在肺癌标本中Wnt5a表达水平的检测上,因此有必要对Wnt5a与NSCLC的关系进行深入研究。目的探讨Wnt5a在NSCLC的表达与病理意义以及对NSCLC细胞增殖及侵袭潜能的影响,为寻找肺癌有效的治疗途径及预后判定指标提供依据。方法1.应用Northern-blot检测43例NSCLC癌组织中Wnt5a mRNA的表达,同时采用免疫组织化学SP法和Western blot技术检测Wnt5a蛋白的表达,统计分析它们与临床病理特征之间的关系并进行生存分析。2.采用基因重组技术,构建人Wnt5a基因正义及RNAi真核表达载体,转染人H157和A549细胞;半定量RT-PCR和Western blot检测细胞转染前后Wnt5a mRNA和蛋白表达的变化。3.应用MTT检测细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期;划痕试验检测细胞迁移力的改变;改良Transwell小室法检测细胞侵袭力的变化。结果1.Wnt5a mRNA在NSCLC癌组织及正常肺组织中的阳性表达率分别为79.1%和45.4%,二者的表达水平也存在差异,前者为0.96±0.65,后者为0.44±0.23,Wnt5a mRNA在NSCLC中表达明显增高,与正常相比具有显著统计学意义(P<0.05=。2.Wnt5a mRNA与NSCLC病理分期、细胞分化程度、有无淋巴结转移及组织学类型、是否吸烟有一定关系:Ⅲ~Ⅳ期(1.24±0.47)较Ⅰ~Ⅱ期(0.58±0.71)增高;细胞分化程度低的(1.27±0.46)较分化程度好的(0.65±0.47)也明显增高;有淋巴结转移的(1.10±0.63)较没有淋巴结转移的(0.67±0.66)增高;鳞癌(1.31±0.65)比腺癌(0.58±0.46)增高,吸烟者(1.26±0.56)较非吸烟者(0.57±0.62)增高(P<0.01或P<0.05)。3.Wnt5a蛋白水平变化趋势与其mRNA基本一致,二者阳性表达之间存在着显著的正相关(相关系数0.74,P<0.01),Wnt5a mRNA与蛋白的表达具有一致性。4.在NSCLC中,Wnt5a阳性患者2年生存率(31.1%,9/29)明显低于Wnt5a阴性患者(71.4%,10/14),差异具有统计学意义(P<0.01)。5.分别对重组质粒pcDNA3.1+-XE58和pAVU6-siWnt5a质粒进行酶切鉴定,酶切片段与插入的目的片段大小相一致;进行测序鉴定所得测序结果经分析比对与GeneBank文献报道一致,未见缺失和突变。6.未经干预的H157和A549对照组细胞增殖指数分别为37.26%和29.01%;转染正义基因组细胞H157-XE58与A549-XE58增殖指数(62.94%,54.49%)增加;RNAi组细胞H157-siWnt5a与A549-siWnt5a增殖指数下降(20.81%,17.66%),正义基因组细胞增殖指数明显高于对照组及RNAi组细胞,RNAi组细胞增殖指数明显低于对照组。7.细胞迁移力和侵袭力的检测:未经干预的H157和A549对照组细胞具有一定的迁移力和侵袭力;正义基因组H157-XE58与A549-XE58细胞转染24h后迁移速度明显加快,划痕区细胞数明显增多(94.1±3.8, 91.1±3.9),细胞迁移距离较远,穿过Matrigel胶的细胞数明显增加(71.3±3.2 , 61.7±3.5) ; RNAi组H157-siWnt5a与A549-siWnt5a细胞的迁移距离明显小于正义基因组及对照组细胞,划痕区细胞数稀少(21.9±2.2,19.6±4.1),细胞迁移不明显,穿过Matrigel胶的细胞数明显减少(22.3±3.2,20.7±3.5)。正义基因组细胞迁移力和侵袭力均明显高于对照组及RNAi组细胞。RNAi组细胞迁移力和侵袭力明显低于对照组。结论1.Wnt5a在NSCLC中不论是mRNA水平还是蛋白水平均明显增高,且与NSCLC的细胞分化程度、组织类型及TNM分期密切相关,提示Wnt5a可能参与NSCLC的发生发展过程。2.体外NSCLC细胞转染人Wnt5a正义基因后细胞增殖能力明显增强,转染RNAi质粒后增殖能力受到显著抑制,初步证实Wnt5a在NSCLC细胞增殖中起着重要作用。3.体外NSCLC细胞转染人Wnt5a正义基因后细胞侵袭能力明显增强,转染RNAi质粒后侵袭能力受到显著抑制,初步证实Wnt5a对NSCLC细胞侵袭潜能有显著影响。4.Wnt5a可以明显促进NSCLC细胞增殖及侵袭潜能增强,此作用可为特异性siRNA所阻断,Wnt5a有可能作为肺癌基因治疗的靶标或药物治疗的靶点。5.Wnt5a表达水平越高,患者预后越差,生存期越短,提示Wnt5a的检测可能作为NSCLC预后的分子指标之一。6.成功构建人Wnt5a基因正义及RNAi真核表达载体并建立稳定的转染细胞株,为进一步研究Wnt5a与肺癌的关系提供了实验平台。