研究目的和内容1.了解广东地区医院感染病原体铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)的耐药情况,掌握地区差异及耐药谱随时间变化趋势,为临床选择适当的抗生素提供依据。2.探索优化适合铜绿假单胞菌的脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)条件,了解医院感染病原体PA分离株的基因多态性,阐明其菌株间的遗传亲缘关系。3.结合流行病学资料分析PA基因图谱的聚类分析结果,鉴别优势克隆菌株的时间、地区以及人群的三间分布,判断爆发菌株和散发菌株。4.了解多重耐药铜绿假单胞菌(Multi-drug resistance pseudomonas aeruginosa, MDRP)常见耐药基因的携带情况,分析比较其耐药谱、基因图谱以及耐药基因携带的关系。研究方法1.菌株的收集方法：2008年1月-2010年8月,对广东地区四所三甲医院(汕头中心医院、深圳儿童医院、广东药学院第一附属医院及广州胸科医院)住院的医院感染患者送检的痰、血液、尿液、粪便和脓液等样本,由医院进行铜绿假单胞菌的分离鉴定,菌株经VITEK232全自动细菌鉴定仪(法国Bio2Merieux)鉴定,并剔除同一患者相同样本重复菌株。2.抗生素敏感性测定方法：按美国临床及实验室标准协会推荐标准,采用纸片扩散法对菌株进行15种抗菌药物的体外药物敏感试验。3.基因分型方法：建立适合铜绿假单胞菌的PFGE分型的实验室条件,对分离株进行PFGE基因分型,采用Bionumerics V4.0软件中的非加权配对算数平均法(UPGMA)进行聚类分析,分析菌株间的亲缘关系。4.PCR扩增法检测多重耐药铜绿假单胞菌分离株中的外膜孔蛋白OprD2及金属β-内酰胺酶耐药基因。研究结果1.广东地区2008-2010年医院感染PA的药物敏感性结果1.1 PA药敏的总体情况本研究共分离到376株医院感染铜绿假单胞菌,对15种常用抗生素(青霉素类、头孢菌素类、其他β-内酰胺类、氨基糖甙类、喹诺酮类、磺胺类)均表现出不同程度的耐药。耐药率从高到低依次如下：头孢唑啉(99.7%)、氨苄西林/舒巴坦(99.5%)、氨苄西林(98.9%)、复方新诺明(98.7%)、头孢噻肟(80.6%)、庆大霉素(50.8%)、氨曲南(46.5%)、哌拉西林/三唑巴坦(45.1%)、头孢砒肟(44.7%)、左氧氟沙星(39.9%)、美罗培南(39.1%)、头孢他啶(38.0%)阿米卡星(37.5%)、环丙沙星(37.0%)、亚胺培南(34.6%)。未发现泛耐药及全敏感菌株。分离株几乎对所有的青霉素类、磺胺类及一代头孢菌素表现出全耐药,对氨基糖甙类、喹诺酮类,特别是碳青霉烯类和三代头孢敏感性较高。1.2 PA药敏的地区差异三地区药敏情况表现略有不同,大部分表现为逐年递增,汕头地区的亚胺培南从2008年的27.3%递增到2010年的59.6%,深圳的亚胺培南、头孢他啶也从2008年的4.2%,4.2%到2010年的20%和23.3%,而广州地区的药敏结果显示包括亚胺培南和头孢他啶在内的大部分抗菌素从2008年的高耐药到2009年有所回落再到2010年慢慢上升的趋势。深圳地区2009-2010年间耐药情况增长幅度大,多数药物耐药性呈翻倍增长,尤为明显的是阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢砒肟、环丙沙星及左氧氟沙星。耐药特点比较结果显示：2008-2010年间,汕头地区PA耐药率变化有统计学意义的是阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南及哌拉西林/三唑巴坦；深圳地区是阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、头孢噻肟、头孢砒肟及左氧氟沙星；广州地区是阿米卡星、庆大霉素、头孢他啶、头孢噻肟、哌拉西林/三唑巴坦及复方新诺明。1.3 PA药敏的时间变化趋势汕头和广州地区耐药情况较为普遍,相对地,深圳地区药物敏感度较高。2008年,阿米卡星、头孢砒肟、环丙沙星、左氧氟沙星在深圳地区未发现其耐药株,在汕头的耐药性已分别高达33.3%、48.5%、45.5%、33.3%,广州是44.1%、73.5%、58.8%、64.7%。汕头和广州耐药性变化较为缓慢或略有下降,深圳地区耐药性随年递增快,2008年汕头、深圳、广州的亚胺培南耐药性分别是27.3%、4.2%及50.0%,头孢他啶耐药性分别是57.6%、4.2%及64.7%,到2010年,汕头、深圳和广州亚胺培南耐药率分别是59.6%、20.0%和41.7%,头孢他啶分别是46.2%、23.3%和40.6%。耐药特点比较结果显示：2008年三地区耐药性变化有统计学意义的是阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢砒肟、氨曲南、哌拉西林/三唑巴坦、环丙沙星及左氧氟沙星；2009年有统计学意义的是阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢砒肟、氨曲南、哌拉西林/三唑巴坦、复方新诺明、环丙沙星及左氧氟沙星；2010年有统计学意义的是阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、头孢砒肟、氨曲南、氨苄西林、环丙沙星及左氧氟沙星。1.4多重耐药铜绿假单胞菌分离株的检出情况376株铜绿假单胞菌中共有84株为多重耐药,多重耐药率为22.3%,呈逐年递增趋势。多重耐药率比较三地区总体差异有统计学意义(x2=39.29,P=0.000)。汕头、深圳地区多重耐药率逐年递增,尤为明显的是汕头地区,三年多重耐药率分别是18.2%、40.7%、53.8%。多重耐药特点比较结果显示：三年间同一地区多重耐药率变化有统计学意义的是汕头地区(x2=10.69,P=0.005),深圳地区(x2=9.78,P=0.008)；三地区间同一时间多重耐药率差异均有统计学意义的是2008(x2=6.30, P=0.043),2009 (x2=24.39, P=0.000),2010 (x2=21.15, P=0.000)。2.医院感染铜绿假单胞菌的PFGE基因分型2.1适应于铜绿假单胞菌的PFGE实验室条件建立当OD值为5.2,裂解时间为20h,限制性内切酶SpeⅠ20OU酶切20h,电泳脉冲时间为2.16s-63.8s,脉冲角度为120°,电场强度为6V/cm,电泳19：30h时,PA的PFGE实验图谱条带数目、大小、亮度及长度均非常合适。2.2376株医院感染铜绿假单胞菌基因分型概况及流行病学调查在使用相同的试剂、仪器和参数的前提下,376株菌经限制性内切酶SpeⅠ酶切后进行PFGE电泳,每株约出现13-20个电泳条带,分子量在30kb-700kb之间。经Bionumerics V4.0软件进行聚类分析,相似值在34.2%-100%之间,可分为357个型(相似值为100%视为同一PFGE型别),共出现16对涉及35株菌同源性为100%,其中汕头共出现4对8株,均发生于ICU与神经外科病房之间的心脑损伤患者的痰与血液样本,同源菌株检出的时间间隔不超过两个月；深圳是7对17株,基本都是从痰标本中检出,多发生于ICU及内科病房,同源菌株检出时间间隔多数在1个月内到4个月之间,最长是8个月；广州3对6株,基本都是来自内科病房的呼吸道患者,时间间隔在一个月内到两个月之间；另外有两对4株分别是广州胸科医院和深圳儿童医院之间,时间分别是2010年10月和2009年6月,标本来源是痰液和大便,以及广州胸科医院和汕头中心医院之间的同一肺疾患者不同时间(2010年的1月和2009年的10月)痰标本中检出。2.384株多重耐药铜绿假单胞菌的基因分型84株多重耐药的PA经Bionumerics V4.0软件进行聚类分析,相似值在62.5%-100%之间,可分为75个型,出现6组同源菌株。不同地区各自出现多个聚类高峰,尤其是汕头,有7株菌的同源性在90.7%及以上。另外,6组同源菌株中有4组(各2株)来自汕头,1组(3株)来自深圳,一组出现于广州和汕头两地区之间。统计检验结果表明在相似度为90%、85%和80%时,多重耐药株与总分离株的分型率差异均有统计学意义。2.434株耐药基因阳性铜绿假单胞菌的基因分型聚类分析显示34株基因阳性菌株的铜绿假单胞菌相似值在64.6%-100%之间,可分为31个型,出现多个聚类高峰,呈现地区聚集,当相似度为90%时,可分为24型,当相似度为80%时,仅可分为13型,共出现2组同源菌株,分别是来自汕头(2株)和深圳(3株)3.多重耐药铜绿假单胞菌分离株的耐药机制研究3.1外膜孔蛋白OprD2检出情况84株多重耐药铜绿假单胞菌中共检出30株OprD2缺失,缺失率为35.71%,其中汕头是13.35%(6/45),深圳是75%(3/4),广州是60%(21/35)。3.2金属β-内酰胺酶检测情况汕头地区未检出金属酶阳性铜绿假单胞菌；广州共检出4株IMP和2株VIM阳性,检出率分别是11.4%和5.7%；深圳检出2株VIM阳性,阳性率为50%,经测序比对,均为IMP-1及VIM-2型。三地区SPM均未检出。研究结论1.广东地区医院感染PA耐药情况普遍,对头孢唑啉、氨苄西林/舒巴坦、氨苄西林及复方新诺明的耐药接近100%,对氨基糖甙类、喹诺酮类尤其是碳青霉烯类和头孢他啶敏感性相对较高,总体上所有抗菌素的耐药性呈现逐年递增趋势,不同地区不同时间均表现出不同的耐药特点,从区域上看,汕头广州耐药性较深圳普遍,从时间上看,耐药增长率深圳>汕头>广州；另一方面,多重耐药株检出率高达22.3%,呈逐年递增趋势,增长率汕头>深圳>广州。2. PFGE在分子水平上有强大的鉴别能力,是一种稳定、精确的基因分型方法,适合作为院内感染的同源性分析。3.2008-2010年间广东不同地区的多家医院病房中存在铜绿假单胞菌的优势克隆株,三地区均出现过小规模的院内流行传播,ICU病房出现频率高,交叉感染可出现于不同科室之间。另外,不同地区之间出现基因型完全一致菌株,揭示及时的流行病学调查的重要性。多重耐药铜绿假单胞菌分离株,尤其是耐药基因阳性的菌株的基因多态性集中,更容易引起交叉感染。4.广东地区亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的耐药机制以外膜孔蛋白OprD2缺失为主,其次是携带IMP-1和VIM-2金属酶基因,未发现携带其他金属酶基因,外膜孔蛋白OprD2和金属β-内酰胺酶介导的耐药可以独立也可以协同起作用。除此之外,亚胺培南耐药铜绿假单胞菌存在其他的耐药机制。5.耐药图谱、PFGE图谱以及耐药基因图谱之间没有必然关联性。