肝素苄基酯制备及肝素废水蛋白回收研究

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肝素具有良好的抗凝血作用,目前被普遍用于手术治疗过程和抗静脉血栓形成等临床实践中,其临床应用价值是至今任何一种药物都无法替代的。其中伊诺肝素钠是目前研究最广、循证医学最多、使用最多的肝素类药品,占据肝素药物市场份额的50%以上。依诺肝素钠生产工艺中最关键的是肝素苄基酯制备,其酯化程度的不同,决定了分子量的大小,得率和效益。同时,在肝素生产中,传统抗凝血特性的效价测定主要依赖肉眼判断,试验误差大;采用国外试剂则价格昂贵。一种便于操作,成本较低且客观,准确,重现性好的效价测定方法,对提升中小企业肝素品质控制、降低生产成本、提高生产效益具有重要意义。此外,我国肝素加工废水约6000t/d,肝素在动物体内多以糖蛋白复合物的形式存在,生产中要用酶将肝素和蛋白分离,所以废水为富含氨基酸的高盐度有机物,COD值高,味道难闻,对环境污染大。但如果能回收废水中蛋白和有机物,不仅能减轻或清除环境污染,且能变废为宝,具有较好的生态和经济效益。针对以上情况,本论文主要研究了肝素苄基酯超声波辅助制备的优化;单通道凝血仪和兔全血法测定肝素钠效价;肝素钠废水蛋白沉淀回收。1、在肝素苄基酯的制备中:首先利用甲醇纯化原料,利用紫外分光度计和高效液相色谱进行了蛋白质、核酸和多硫酸软骨素的检测;然后通过单因素实验,确定了超声波功率、时间对酯化率的影响。最后在此基础上利用design expert软件优化设计实验,得到最佳工艺参数为:温度控制在35-40度,功率为400W,超声反应时间5.5h,处理酯化率优于对照样(反应25小时)的酯化率(4.65%),为5.35%,经纯化蛋白核酸含量明显降低,原料不含多硫酸软骨素。2、利用羊血浆活化凝血活酶时间来测定肝素钠效价的同时引入单通道凝血仪,实现微量、自动化操作。同时与中国药典的兔全血法作对比。均采用中国药典生物效价(3.3)法进行统计计算,经可行性检测证明测定的样品效价PT准确可行,两种方法的可行限率均符合药典要求。单通道凝血仪APTT法测得效价为90.65 IU/mg,兔血法测得效价为92.96 IU/mg。3、肝素钠废水蛋白沉淀回收的试验中:先初筛蛋白絮凝剂,再通过单因素试验,确定了絮凝剂FeCl3、膨润土、硅藻土的添加量,pH值对蛋白沉淀量的影响,在此基础上,采用Box-Benhnken Design(Design expert.v8.0.6.1)设计响应面试验,得到的较佳工艺参数为:pH7.5、沉淀剂FeCl30.38%、膨润土1.9%、硅藻土4.25%时,肠衣肝素废水蛋白沉淀率达51.13%,废水溶液变清澈,COD去除率达80.94%。
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