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研究背景:心血管疾病尤其是缺血性心脏病的治疗取得了很大的改善,可是心衰作为各种心血管疾病的终末期表现,是心血管疾病高致死率和高致残率的主要原因。尽管心衰的治疗已经取得了很大的进展,但是现有的治疗仍不能最大程度地控制心衰病程的进展和死亡。近年来逐渐认识到,心肌细胞代谢在充血性心衰发生发展中发挥着重要作用。目前认为,心肌能量代谢有望成为心衰的治疗靶点。各种原因导致的心衰线粒体结构和功能都受到破坏,线粒体功能障碍是心肌能量饥饿的根本原因,如何减少线粒体的破坏,改善线粒体的氧化磷酸化功能是心衰心肌能量代谢治疗的关键。了解心衰过程中引起线粒体功能障碍的复杂机制可以为心衰的治疗寻找新的靶点。PDE5(phosphodiesterase5)抑制剂是临床上批准用于治疗肺动脉高压和男性性功能障碍的成熟药物,近年来,大量的临床和实验室致力于研究PDE5抑制剂在心血管方面的保护作用,PDE5抑制剂可以对抗心肌缺血再灌注损伤,可以抑制压力超负荷心衰中心肌的重构,减少心梗后心肌细胞的凋亡,改善心功能。PDE5抑制剂的心血管保护作用通过增加细胞c GMP水平来实现,而有报道称c GMP依赖的信号通路可以调控脂肪细胞线粒体的生物发生和功能。然而,PDE5抑制剂对于心肌线粒体能量代谢的调控尤其是在心梗后心衰中的保护作用是否与改善线粒体功能有关以及其具体的机制尚待进一步研究。研究目的:1.观察PDE5抑制剂sildenafil能否改善心梗后心衰模型中线粒体结构和功能破坏,进而抑制心肌重构,改善心功能;2.探讨sildenafil改善线粒体功能的机制,观察Sirt3和PGC-1α在心梗后心衰中的表达变化以及sildenafil对其表达影响;3.明确sildenafil对离体心肌细胞缺氧损伤的保护,探讨Sirt3/PGC-1α信号通路在此过程中的作用。4.评价sildenafil介导的线粒体保护在心梗后心衰以及其它能量代谢障碍性疾病中的潜在作用。研究方法:1.选取8周龄的雄性C57BL/6小鼠,通过结扎左冠状动脉前降支(LAD)方法建立心肌梗死(MI)模型,3天后利用超声评估心脏功能判定模型建立成功;随机分为两组,分别用生理盐水和PDE5抑制剂sildenafil腹腔注射4周,同时设立假手术组(Sham组)术后4周检测小鼠心脏功能变化;2.分离培养乳鼠心肌细胞,采用缺氧去血清处理24小时模拟在体心肌缺血过程;3.采用培养心肌细胞转染Sirt3 sh RNA的方法,以降低心肌细胞Sirt3的表达;4.MI模型建立4周以后取小鼠心脏,多聚甲醛固定后行马松和天狼星红染色检测小鼠心肌纤维化程度;梗死周边区心肌组织提取蛋白行Western blot检测心肌纤维化标志物基质金属蛋白酶-2(MMP2)和基质金属蛋白酶-9(MMP9)的变化;5.MI模型建立4周以后取梗死周边区心肌组织,4%戊二醛固定后制成心肌超薄切片,通过投射电镜来观察心肌线粒体超微结构;6.MI模型建立4周以后取梗死周边区心肌组织,提取新鲜线粒体,利用seahorse生物能量代谢测定仪检测各组线粒体耗氧率(OCR)和呼吸控制率(RCR)的变化;7.提取心肌线粒体进行JC-1染色或心肌组织冰冻切片行JC-1染色评估心肌组织线粒体膜电位(MMP)的变化,JC-1染色流式细胞术方法检测离体培养心肌细胞MMP的变化;8.利用萤火虫荧光素酶和荧光素ATP检测试剂盒检测心肌组织和心肌细胞ATP的生成;9.运用TUNEL法、Caspase 3活性测定、流式细胞术方法检测心肌组织及心肌细胞凋亡;10.运用组织非放射性蛋白激酶G活性试剂盒检测心肌组织PKG活性;11.运用RT-PCR检测心肌组织及心肌细胞Sirt3 m RNA水平;12.运用Western blot法检测心肌组织及心肌细胞PDE5a,Sirt3,PGC-1α,乙酰化的PGC-1α的表达和变化。研究结果:1.MI模型建立4周以后,小鼠心脏收缩功能包括左室射血分数(LVEF)和短轴缩短分数(LVFS)均显著下降;心脏明显扩大,心肌纤维化程度显著增加;心肌组织TUNEL阳性细胞增多,表明心肌细胞凋亡在心梗后心功能恶化和心肌重构中起重要作用。Sildenafil治疗组上述指标均明显改善,提示sildenafil可以减少心肌细胞凋亡,减轻心肌重构,改善心功能。2.MI模型建立4周以后,心肌组织线粒体超微结构发生明显改变,主要表现为线粒体排列紊乱,线粒体嵴断裂,线粒体肿胀以及线粒体空泡化发生比例明显增多;而线粒体功能指标包括线粒体耗氧率和呼吸控制率均明显下降,同时线粒体膜电位下降,ATP的生成明显降低。同样sildenafil处理组线粒体结构破坏程度减轻,仅有少量的线粒体肿胀现象,无明显线粒体空泡化发生。线粒体呼吸功能和线粒体膜电位均得到改善,提示sildenafil对心梗后心衰的心脏保护作用可能是通过改善线粒体结构和功能实现的。3.心梗后心衰模型中,PGC-1α表达未出现明显变化,而PGC-1α的乙酰化水平明显升高,提示PGC-1α的活性降低;Sirt3的m RNA和蛋白表达也下降。Sildenafil治疗可以明显上调Sirt3的表达,降低PGC-1α的乙酰化水平,恢复PGC-1α的活性。4.原代乳鼠心肌细胞缺氧去血清处理24h以后,心肌细胞的线粒体膜电位明显下降,ATP生成减少,同时心肌细胞凋亡增加;预先给予sildenafil处理后心肌细胞的膜电位破坏明显减轻,ATP生成增多,同时心肌细胞的凋亡减少。5.原代乳鼠心肌细胞缺氧去血清处理24h以后,Sirt3的表达明显下降,PGC-1α的乙酰化水平升高,sildenafil预处理可以部分逆转这一改变。6.原代乳鼠心肌细胞转染Sirt3 sh RNA质粒下调Sirt3表达后,心肌细胞对缺氧的耐受性减弱,心肌细胞缺氧损伤加剧,表现为细胞凋亡增多,线粒体膜电位破坏加剧,ATP生成量进一步降低,同时sildenafil的保护作用部分削弱。研究结论:1.PDE5抑制剂sildenafil减少心梗后心衰模型中心肌细胞的凋亡,减轻心肌重构,改善心脏收缩功能。2.Sildenafil减轻心梗后心衰模型线粒体超微结构和线粒体膜电位的破坏,改善线粒体的呼吸功能,从而提高ATP的生成。3.Sildenafil对心肌线粒体结构和功能的影响可能与Sirt3的表达上调,PGC-1α的乙酰化水平降低,PGC-1α的活性升高有关。4.Sildenafil减少离体心肌细胞缺氧损伤中细胞凋亡,减轻心肌线粒体膜电位破坏,增加ATP的生成。5.下调Sirt3表达增加心肌细胞缺氧损伤。6.Sildenafil的心肌细胞线粒体保护作用部分是通过调控Sirt3/PGC-1α信号通路实现的。综上所述,我们的研究证明,PDE5抑制剂sildenafil可以通过调控线粒体功能实现其对心梗后心衰心肌细胞的保护作用,这一作用是通过调控Sirt3/PGC-1α的信号通路来实现的,这一发现为心衰线粒体能量代谢治疗提供新的靶点和干预手段,同时拓宽了sildenafil的临床应用,为其用于其他能量代谢障碍性疾病提供实验证据。