背景：化疗是治疗脑胶质瘤(Glioma)重要的辅助治疗方法之一,但目前胶质瘤化疗所使用药物种类有限。口服烷化剂替莫唑胺(temozolomide,TMZ)生物相容性好,能够透过血脑屏障,是目前临床上最常应用的抗胶质瘤药物,是治疗胶质瘤首选的标准化疗药。TMZ进入人体后分解为5—氨基—咪唑—4—酰胺(AIC)与重氮甲烷,即活性的烷基化物质,产生细胞毒性作用,使细胞DNA中鸟嘌呤的N7和O6位置上发生甲基化,在DNA复制过程中,错配修复系统不能为第6位氧原子甲基鸟嘌呤找到配对碱基,导致子链DNA中有缺口形成。缺口随细胞分裂而逐渐积累,最终阻碍复制启动,从而使细胞停滞在G2/M期,细胞发生凋亡。但是这种作用机制会被胶质瘤细胞内的耐药相关蛋白O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)所逆转,MGMT能修复烷化剂导致的DNA烷基化损伤,这是胶质瘤细胞对亚硝脲类药物及TMZ产生耐药的主要原因,从而限制了TMZ的抗肿瘤作用。如何运用化疗增敏剂提高TMZ对恶性胶质瘤的细胞毒作用是近年来研究的一个热点。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是一种天然诱导剂,能诱导细胞分化、抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡从而具有抗肿瘤作用,已在造血系统肿瘤及其他实体肿瘤(肝癌、肺癌、直肠癌、乳腺癌等)显示出其抗肿瘤作用。尤其是用ATRA治疗急性早幼粒细胞性白血病效果确切,可诱导完全缓解。有研究表明,ATRA对C6胶质瘤细胞的增殖具有抑制作用,且抑制率随ATRA浓度和处理时间的延长而增加,具有时间和浓度的依赖性。作为一种脂溶性化合物,ATRA可以通过血脑屏障,并在脑组织内浓集,这是其可用于治疗脑胶质瘤的基础。目前,维甲酸对胶质瘤作用机理还不完全清楚,它涉及到与增殖、分化、凋亡调节有关的一整个网络系统。目前关于ATRA在治疗胶质瘤方面报道不多,单独应用时其抗肿瘤作用有限,但有报道证明其通过诱导细胞分化及抑制增殖,可增加其他化疗药物如紫杉醇、柔红霉素及Y-干扰素等对胶质瘤细胞毒作用的敏感性。本实验以人胶质瘤细胞株U251为实验模型,将ATRA作为TMZ抗肿瘤作用的增敏剂,观察ATRA与TMZ联合作用对U251细胞的生长抑制是否存在协同作用,ATRA是否对TMZ诱导的凋亡效应具有增敏作用,并通过检测与细胞分化和凋亡相关的调控蛋白及细胞表型分子,如CD133表型、Bcl-2、BAX、caspase-3、caspase-8、caspase-9等凋亡蛋白的表达情况初步分析其可能的作用机制,为克服胶质瘤细胞对TMZ耐药、提高TMZ体外抗胶质瘤作用的进一步研究提实验基础。方法：1、细胞培养：胶质瘤细胞株U251在含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12培养基中于37℃、5%CO2培养箱中培养,隔1-2天换液一次,4-5天传代一次。取对数生长期细胞进行实验。2、MTT法检测细胞增殖抑制率：取对数生长期的细胞,胰酶消化后混悬,细胞计数后调整细胞浓度,接种于96孔板,每孔100μl,含5×103个细胞。设对照组、ATRA设10、20、30、40mM的浓度,TMZ设100、200、300、400mM的浓度,每组4个复孔。每次实验共种植5个板,置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养,分别于培养24、48、72、96、120h后弃上清,加入相应浓度的药物,对照组加入相应浓度的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。每板加药后置于5%CO2、37℃培养箱中继续孵育24h后行MTT比色实验,加入MTT(5g/L)20μl,孵箱培育4h,弃上清,加入150μ1DMSO,摇床振荡10min,酶标仪490nm测OD值。绘制生长抑制曲线图,并做统计学分析。根据上述实验结果,选取ATRA浓度为20mM培养48h,弃上清,再加入浓度为TMZ200mM培养48h后,行MTT检测细胞增殖抑制率,并与两药相同浓度作用48h后的抑制率比较。计算细胞生长抑制率%=(1—实验组OD值/对照组OD值)×100%。3、分组及药物干预：设空白对照组(等量DMEM/F12培养基加等量DMSO)、ATRA组(20mM)、TMZ组(200mM)、联合作用组(ATRA浓度为20mM+TMZ浓度为200mM)。两药单用组分别按上述分组加入各药作用48h；而联合用药采用序贯加药的方法,先加ATRA (20mM)作用48h,再弃去培养基,加入TMZ(200mM)作用48h。4、划痕实验及细胞形态学变化：以ATRA、TMZ、联合用药组按上述浓度及方法作用于U251细胞,于37℃、5%CO2条件下继续培养,于第12、24、48h用倒置相差显微镜观察细胞形态变化。取对数生长期细胞按1.0×106/ml的密度接种于6孔板中,用含10%FBS的DMEM/F12培养,每孔培养24h后待细胞生长至板底80%以上时,以10μl加样枪头在每孔正中划一直线,无菌PBS洗涤3次去除悬浮细胞,按照上述分组加药培养后,用倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况并拍摄照片。5、免疫荧光检测细胞CD133细胞阳性率取对数生长期U251细胞接种于6孔板内,在培养板孔的底部加入一片处理好的载玻片,让细胞生长于载玻片上,每孔加入2ml含10%FBS的DMEM/F12培养基培养,待细胞生长良好,按上述分组处理,对照组加入等量培养基及DMSO,培养后载玻片捞片,用PBS洗涤盖玻片3次,多聚甲醛的PBS缓冲液中固定10分钟,去除甲醛；用PBS缓冲液洗涤细胞三次,每次10分钟。在0.5%的Triton-X100中浸润10分钟,用PBS缓冲液洗涤细胞三次；滴力0.01MPBS1:10稀释的正常山羊血清封闭,室温下10分钟,弃去液体,滴加0.01M适当稀释的兔抗人CD133单克隆抗体,4℃下过夜,PBS漂洗2分钟×3次。用标记FITC荧光素的羊抗兔IgG抗体二抗作用,37℃30分钟,PBS漂洗5分钟×4次,水溶性封片剂封片,荧光显微镜下观察。以495nm荧光激发,阳性细胞发出绿色荧光。计算CD133细胞阳性率=CD133阳性细胞/贴壁细胞×100%。6、流式细胞仪测细胞凋亡率：取处于对数生长期的细胞,消化后传至6孔板,贴壁生长24h后,按上述分组加药,每组在倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。用DMEM/F12培养基作空白对照,胰酶消化后悬浮细胞,加入PBS漂洗、离心2次,用500μl结合缓冲液(bind buffer)重悬细胞,加入5μlAnnexinV-FITC、5μl碘化丙啶(PI)染色液,混匀后冰浴避光放置15min,流式细胞仪检测,用Cell Quest软件进行数据分析。以Annexin V-FITC+PI+和Annexin V-FITC+PI-为凋亡细胞,每次计数10000个细胞,计算凋亡率。7、Western blot法检测细胞蛋白表达根据上述分组及剂量处理细胞后检测。PBS漂洗细胞两次,加入预冷的细胞总蛋白提取试剂,作用20min后4℃下12000r/min离心2min,取上清,Bradford法检测蛋白浓度。在细胞裂解液中加入1/4体积SDS-PAGE缓冲液,每泳道上样40μg,恒压电泳分离蛋白后转移至PVDF膜。室温下5%脱脂奶封闭30mmin。分别加入Bcl-2(1:1500)、Bax (1:1000)、 caspase-3(1:500)、caspase-8(1:1000)、caspase-9(1:500)、β-Actin (1:1000)一抗,室温2h,PBST票洗3次,加入HRP标记的抗兔IgG抗体(1：2000)室温孵育45min。PBST先膜,ECL法显影。以β-Actin (1:1000)作为内参。用AlphaEaseFC软件分析每组内每个蛋白的灰度值,以同一样品中目的蛋白与内参灰度值的比值作为蛋白的相对含量。8、统计学方法采用SPSS13.0统计软件分析,结果用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用q检验,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果：1、细胞增殖抑制作用当ATRA浓度为10mM时,作用后24h不能产生抑制细胞增殖作用,相反对细胞增殖有一定促进作用,表现为吸光度增加,抑制率为负值(-13.35±6.84)%；作用48h后开始产生抑制作用,但48h时抑制率低,仅为(13.18±9.46)%。用ATRA浓度为20、3O、40mM时随浓度增加以及作用时间的延长,抑制率逐渐增加,而48h时增加最明显,随后生长抑制曲线升高幅度变得平缓,其中以20mM的ATRA抑制率增加最快,达(43.64±5.09)%,与10mM组相比有统计学差异(P<0.01)。而TMZ随浓度增加及作用时间延长抑制率逐渐增加；浓度为100mM时抑制率低,在48h时其抑制率仅为(23.37±8.19)%,而200mM时抑制率达(35.77±5.39)%,差异有统计学意义(P<0.01)。而两药作用72h、96h、120h时抑制率增加均明显变慢,这三个时间点之间差异无统计学意义(P>0.05)。根据统计数值作出两药的增殖抑制曲线。我们看到用ATRA浓度为20mM、TMZ浓度为200mM作用48小时后对细胞增殖的抑制效应明显,故我们随后选取ATRA浓度为20mM、TMZ浓度为200mM进行分组及联合用药的用药浓度。在联合用药组中,用ATRA浓度为20mM培养48h,再加入浓度为TMZ200mM培养48h,行MTT检测细胞增殖抑制率为(76.33±5.65)%,与ATRA组及TMZ组差异均有统计学意义(P<0.01)；而ATRA组与TMZ组相比差异无统计学意义(P>0.05)。2、倒置相差显微镜下U251细胞形态变化：对照组U251细胞多数呈梭形,突触较多,折光度好,胞浆丰富,边缘清晰,与培养板黏合紧密。ATRA、TMZ作用12、24、48h后,见多数细胞变圆、缩小,折光度降低,部分细胞漂浮,随着时间延长,上述变化越来越明显。而联合用药组作用96后,可见大部分细胞变圆、缩小、脱壁漂浮,边缘毛糙,折光度降低,可见胞膜包裹的细胞碎片。在划痕实验中,各组均有一条等宽无细胞划痕区。按上述分组药物作用后,对照组细胞迁移能力强,基本覆盖划痕区;ATRA、TMZ组也可见细胞的迁移,划痕宽度减小,但迁移能力弱,仅部分覆盖划痕区；联合用药组的细胞未见明显迁移,细胞划痕区与用药前相比无明显变化。3、免疫荧光检测细胞CD133细胞阳性率在495nm荧光激发下,标记FITC荧光素的二抗在免疫荧光镜下发出强烈的绿光,CD133+细胞标记在细胞膜上,荧光镜下细胞可呈圆形或类圆形,数量较多时易聚集成簇。按上述各组药物干预后,对照组CD133细胞阳性率为(7.05±0.27)%：ATRA组阳性率明显下降,为(0.66±0.30)%；在TMZ组中,其阳性率最高,达(36.32±3.22)%；而在联合用药组中,其阳性率回落,为(4.70±0.52)%。各组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。4、ATRA与TMZ对U251细胞的促凋亡作用20mM ATRA、200mM TMZ作用48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,两药对U251细胞均有促凋亡作用,凋亡率分别为(24.93±4.58)%、(21.36±3.76)%,而联合用药组促凋亡作用明显增强,凋亡率达(41.66±5.02)%。两药单用组细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.01),而联合用药组细胞凋亡率明显高于两药单用组及对照组(P<0.01)。说明ATRA可明显促进TMZ对U251细胞的凋亡作用。两药单用组之间对比无明显统计学差异(P=0.05)。5、Western blot测U251细胞Bcl-2、BAX、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达结果显示在各用药组中BAX、caspase-3、caspase-8、caspase-9均有不同程度表达增高,而在联合用药组中表达最高；而Bcl-2表达相反,在各用药组中表达下调,联合用药组最低；各用药组与对照组比较、联合用药组与两药单用组差异均有统计学意义(P<0.01),而ATRA组与TMZ组两药单用组之间Bcl-2比较无统计学意义(P>0.05),而Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9在ATRA组表达较TMZ组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1、在体外实验中,ATRA、TMZ两药单用均可显著抑制胶质瘤细胞株U251的增殖,抑制细胞迁移能力,当两药联合应用时上述作用明显加强。2、ATRA、TMZ对U251胶质瘤细胞株的抑制作用随用药浓度的增加及作用时间的延长而增强,即具有剂量依赖性及时间依赖性。3、ATRA和TMZ两药均能明显诱导U251细胞凋亡,而序贯应用ATRA及TMZ作用于U251细胞后,能显著增强诱导凋亡作用,即两药联合应用具有协同作用,证明ATRA对TMZ对U251细胞的细胞毒作用具有化疗增敏作用。4、ATRA、TMZ对U251细胞的抑制增殖、促进凋亡作用的机制可能与下调U251细胞内Bcl-2、上调Bax、caspase-3、 caspase-8、caspase-9等蛋白表达水平有关,而ATRA对TMZ对U251细胞的化疗增敏作用可能与ATRA诱导U251细胞株内CD133阳性细胞分化、减少其数量有关。