黄原胶(xanthan gum)是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的一种细胞外杂多糖,相对分子质量(relative molecular weight, Mr)分布范围为2×106-2×107,具有高稳定性、假塑流变性、增稠性、悬浮性和乳化性以及安全性的特点。在医药领域中,黄原胶主要用作药用辅料。黄原胶本身具有的特殊理化性能使其在生物医药领域具有较大开发潜力。目前已建立适合工业化生产的注射用黄原胶原料药制备工艺,制定了质量标准,已进行对兔实验性骨关节炎的疗效和作用机制的研究。根据黄原胶高Mr、高黏弹性和高稳定性的性质,在术后防粘连等领域中还可有应用。Mr是表征黄原胶特性的基本参数之一,也是工业生产中质量检测的一个重要指标。不同Mr的黄原胶表现出不同的理化特性,其用途也不同。黄原胶的高稳定性、高黏弹性等特性与其Mr密切相关,Mr越大,黄原胶溶液的黏度越高,黏弹性越好。因此,宜加大对高Mr黄原胶的生产、开发力度,进一步拓展黄原胶在医药领域的应用范围。本课题通过优化发酵工艺进一步提高了黄原胶的Mr；制备了不同Mr的黄原胶,运用近红外光谱分析技术(near-infrared spectroscopy,NIRS)建立了黄原胶Mr的定量分析模型,实现了黄原胶Mr的快速测定；考察了不同Mr黄原胶对大鼠术后腹腔粘连的预防效果。1高Mr黄原胶的发酵优化目的通过发酵优化获得高Mr的黄原胶,建立高Mr黄原胶的发酵工艺。方法使用摇瓶发酵,以黄原胶粗品溶液的黏度为考察指标,通过对发酵温度、接种量和发酵时间等条件以及氮源、碳源等培养基组成的考察,确定培养条件。随后进行10L发酵罐发酵条件的优化,确定最终发酵工艺条件,并进行了50L规模的中试放大。黄原胶精制品Mr的测定采用体积排阻色谱结合多角度激光散射法(size exclusion chromatography combined with multi-angle laser light scattering, SEC-MALLS),为保证测定结果的准确性,测定了黄原胶精制品的dn/dc值。结果优化后的发酵培养基及工业化发酵工艺条件为：葡萄糖4%,豆饼粉0.3%,酵母粉0.05%,柠檬酸0.1%,硫酸镁0.01%,碳酸钙0.4%,接种量4%,温度28℃,发酵72 h,pH=7.0。采用补料分批发酵工艺,葡萄糖初始浓度2%,在第42 h一次性补加2%的葡萄糖。测得黄原胶分子在NaCl溶液中的dn/dc值为0.163。发酵优化后黄原胶的Mr6.91×106,较优化前Mr提高了30.4%。结论确定了高Mr黄原胶的工业化发酵工艺,筛选到了高Mr的黄原胶。2基于近红外光谱技术的黄原胶Mr快速检测研究目的采用MRS结合偏最小二乘(partial least square, PLS)算法,建立一种快速检测黄原胶Mr的方法。方法采用超声降解法制备了一组具有一定Mr梯度的粉末状黄原胶样品,样品标准Mr的测定采用SEC-MALLS法。采集样品的近红外光谱并与SEC-MALLS测得的Mr数据进行关联,采用主成分分析法对样品集进行划分,建立黄原胶Mr的NIRS分析模型。建模过程中,对光谱预处理方法和建模光谱区间进行选择和优化,并对比了两种采样方式,即积分球采样模块和光纤采样模块对建模效果的影响。结果 两种采样方式均能实现黄原胶Mr的定量分析,而使用光纤采样模块采样的建模效果要优于使用积分球采样模块。最终,使用光纤模式采集光谱以获得最佳的模型效果,选取多元散射校正和均值中心化作为最佳的光谱预处理方法,在4 000-4 900 cm-1、5 465-7 100 cm-1和7 345-8 240 cm-1的光谱范围内建立黄原胶Mr的NIRS定量分析模型。该模型的校正集决定系数(R2c)、验证集决定系数(R2p)、剩余预测偏差(RPD)和预测均方根误差(RMSEP)分别为0.967、0.975、6.028和0.250×106。采用最佳PLS模型,从Mr检测范围、模型的线性、方法的准确度以及精密度等方面,对黄原胶Mr的NIRS分析方法进行了方法学验证。结果表明,在Mr为0.844×106-5.962×106的范围内具有良好的线性,R2=0.969,验证集样品的NIRS预测值与SEC-MALLS测定值之间无显著性差异,重复性和中间精密度考察的相对标准偏差小于5%,测量的准确度和精密度能够满足黄原胶Mr的实际检测要求。从样品及样品制备方法、采样方式和样品含水量3个方面探讨了运用NIRS技术检测黄原胶Mr的影响因素,发现样品的含水量是最主要的影响因素。在此基础上,提出了该方法在实际运用中所应注意的操作规程,即：控制样品的含水量,选择光纤模式采谱,防止样品吸湿,尽量缩短光谱的采集时间,以减少样品含水量对该方法造成的影响。结论该方法简单、实用,实现了黄原胶Mr的快速测定,其准确度和精密度能够满足实际检测要求,有望成为一种黄原胶生产过程中快速检测Mr的方法,可以作为质控的标准,在工厂中实现对黄原胶Mr的在线分析。3黄原胶预防大鼠术后腹腔粘连的实验研究目的考察不同浓度及不同Mr黄原胶预防大鼠术后腹腔粘连的效果,评价腹腔注射黄原胶的安全性。方法手术造大鼠腹腔粘连模型后,在盲肠与腹壁受损部位分别喷涂0.5%、1%和2%(w/v)的黄原胶注射液、医用透明质酸钠凝胶(1.2%)或生理盐水各1 mL。7 d后取样,观察动物整体及局部反应,检测血液学及血液生化指标,观察心、肝、肾组织病理学变化并评价防粘连效果。使用Mr分别为6.91×106、4.75×106和2.51×106的黄原胶制备1%的黄原胶注射液。手术造模后,在受损部位喷涂不同Mr黄原胶注射液、透明质酸钠凝胶或生理盐水各1 mL。7 d后取样,评价不同Mr黄原胶腹腔注射的安全性及防粘连作用效果。使用旋转流变仪对比了不同Mr黄原胶注射液的流变学特性。结果与生理盐水组相比,不同浓度及不同Mr黄原胶组大鼠体重、血液学及血液生化指标等均无明显改变(P>0.05)；心、肝、肾组织未见明显病理改变。与生理盐水组相比,喷涂黄原胶后,腹腔粘连的发生率和严重程度明显降低(P<0.05)。黄原胶的浓度越高,防粘连效果越好。1%高Mr黄原胶的防粘连效果优于低Mr黄原胶。与1.2%医用透明质酸钠凝胶相比,高Mr的黄原胶在低剪切速率下具有更高的黏度和凝胶硬度。结论在大鼠腹腔喷涂不同浓度(0.5%～2%)及不同Mr的黄原胶1 mL,全身及局部未见明显毒性作用。黄原胶能够显著降低模型动物术后腹腔粘连的发生率和严重程度。1%高Mr黄原胶的防粘连效果显著优于1.2%医用透明质酸钠凝胶(P<0.05)。