目的本课题为国家自然科学基金“基于脑微透析技术的川芎-天麻升降佐制药性配伍研究(NO.81274107)”部分研究内容。课题组前期对川芎-天麻药对的主要有效成分进行了研究,发现不同配比药对中有效成分的含量有明显差异,并且有药效试验表明川芎-天麻药对对大鼠肝阳上亢及血瘀型偏头痛都具有较好的药效,不同配比药对药效学指标具有明显差异。本研究在前期研究的基础上进一步采用冰水浴联合注射肾上腺联合电刺激三叉神经节造血瘀型偏头疼模型,利用该模型筛选出了对血瘀型偏头痛治疗具有较好疗效的方剂。并采用微透析技术联合UPLC-MS法在大鼠血瘀型偏头痛模型的体内进行药动学研究,分别从药效学以及药动学方面探讨不同配比川芎-天麻对治疗血瘀型偏头痛的可行性及差异性。方法1川芎-天麻不同配比对血瘀型偏头痛药效学研究1.1血瘀型偏头痛模型的建立皮下注射盐酸肾上腺素,共两次,两次间隔4h,并于第一次注射后2h将大鼠浸于5-8℃的水中冰浴5min,10%水合氯醛麻醉大鼠后,固定在立体定位仪上,定位后用牙科钻插孔,然后将电极插入三叉神经节上,调试电刺激参数后刺激10 min。1.2 ELISA 检测血液及脑匀浆中 NO、NOS、CGRP、ET、TXB2、6-Keto-PGF1α用酶联免疫法检测血清中CGRP、NO、NOS、ET、TXB2和6-Keto-PGF1α的含量,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,SPSS20.0统计软件分析。2 UPLC-MS同时测定血透析液中川芎嗪、阿魏酸方法的建立及方法学考察2.1液质条件液相条件:色谱柱为 Kinetex C18(100×2.1mm,2.6um),乙腈 A-0.005%甲酸 B,梯度洗脱,流速为0.2mL·min-1,进样量为10μL,柱温为室温,托盘温度为4℃。质谱条件:离子源为大气压电喷雾离子源(ESI),扫描方式:选择离子反应监测(SRM),离子源温度:350℃,鞘气(Arb):33,辅助气(Arb):23,所有气体均为氮气。2.2方法学考察标准曲线和定量下限:精密称取盐酸川芎嗪、阿魏酸标准品,用林格氏液定容于10ml容量瓶,作为标准品母液。对母液进行倍比稀释得到8个浓度,测定记录峰面积,得回归方程和标准曲线。基质效应:取林格氏液配制的FA/TMP高、中、低三个浓度的含基质样品,获得相应峰面积;另取甲醇替代林格氏液,同法操作,制备3个质量浓度的参比样品进行分析,获得无基质的峰面积(6次测定的平均值)。以每一浓度2种不同处理方法的峰面积比值计算基质效应。精密度考察:分别配制阿魏酸及川芎嗪定量下限(LLOQ)即低、中、高3个质量浓度的QC样品,每一质量浓度6样本,随行标准曲线,连续测定3d,以当日的标准曲线计算LL0Q和QC样品的浓度,与配制浓度对照,求得阿魏酸、川芎嗪质控样品及定量下限的批内、批间精密度。稳定性考察:给药后收集一个约lOOul的透析液样品。本实验将样品贮存于0-4℃的冰箱,每隔2h进样,测定峰面积。3血液微透析法的建立及影响因素的研究3.1大鼠微透析实验方法的建立探针植入方法:20%乌拉坦溶液按0.8ml/100g麻醉大鼠,钝性剥离颈静脉,结扎远心端,植入血液探针,用细线将探针固定。完成探针植入后,以确定流速灌流,平衡1h后每隔30mmin收集一份透析液,连续收集8小时。3.2川芎嗪、阿魏酸微透析体外回收率及体内稳定性实验考察流速对探针回收率的影响,用空白林格氏液不同流速灌流,血液探针置于已知FA/TMP浓度的含药林格氏液中。每种流速在平衡0.5 h后收集5份样品,UPLC-MS测定样品和含药林格氏液中药物浓度。考察浓度对探针回收率的影响,将探针分别置入已知FA/TMP浓度的含药林格氏液,以空白林格氏液一定流速灌流探针,每种浓度中平衡0.5 h后收集5份样品,UPLC-MS测定样品和含药林格氏液中药物浓度。考察体内稳定性,植入探针后,用已知FA/TMP浓度的含药林格氏液以一定的流速灌流,每20min收集一次透析液,灌流8h,UPLC-MS测定样品和含药林格氏液中药物浓度。3.3连续使用5次的探针回收率的比较取SD大鼠5只,植入探针后,用已知浓度FA/TMP浓度的含药林格氏液以恒定的流速灌流,每只大鼠在平衡1 h后接收5份样品,UPLC-MS测定样品和含药林格氏液中药物浓度。4川芎-天麻不同配比在血瘀型偏头痛大鼠体内的药动学研究将造模后的大鼠随机分为三组:川芎单味药组,川芎-天麻1:0.25(配比剂量即4:1)组,川芎-天麻1:1组,植入探针后,平衡系统。给药后2min(去除管路中的空白林格氏液)开始收集透析液。采用血液微透析法取样,UPLC-MS测定FA/TMP含量,用PKSolver药动学软件计算药动学参数。结果1.偏头痛造模电刺激三叉神经时大鼠咀嚼肌明显收缩、口鼻分泌物增多,另外利用激光多普勒血流仪检测数据进行血瘀型偏头痛效果评价,与正常对照组比较,模型组PU值显著降低,具有显著性差异(P<0.05),因此从血流量值数据显示本实验大鼠急性血瘀型模型成功。2.药效学指标用SPSS20.0统计软件分析,组间比用单因素方差分析法(One-way ANOVA),显著性水平以P<0.05和P<0.01表示。模型组与正常组比较血清中NO、NOS、CGRP、6-Keto-PGF1α均增高,脑匀浆中 NO、NOS、CGRP、6-Keto-PGF1α、ET 均升高。3.建立UPLC-MS法测定FA/TMP的方法学考察,专属性考察,FA/TMP峰型良好,杂质无干扰,出峰时间分别约为3.02/2.82min。方法学考察所得回归方程分别为Y=478.01X+48.848,r=0.9967,Y=8352.8 X-2151.9,r=0.9932,FA 的浓度在线性范围内线性关系良好,TMP在线性范围内线性关系良好;阿魏酸高、中、低三个浓度质控样品的批内/批间的精密度(RSD%)分别为3.03/2.22、1.94/2.06、4.01/3.73,川芎嗪高、中、低三个浓度质控样品的批内/批间的精密度(RSD%)分别为4.71/1.48、2.81/1.78、2.51/3.46。FA在高、中、低3个质量浓度的基质效应分别为96.07%(RSD=2.73%),96.84%(RSD=0.91%),94.41%(RSD=1.18%);在 TMP 在高、中、低 3 个质量浓度的基质效应分别为 101.27%(RSD=0.38%),101.78%(RSD=1.64%),100.66%(RSD=3.33%)。RSD均低于15%,符合有关规定。本实验将样品贮存于0-4℃的冰箱,每隔2h进样,阿魏酸高、中、低三个浓度质控样品的稳定性(RSD%)分别为8.46、8.80、5.74,川芎嗪高、中、低三个浓度质控样品的稳定性(RSD%)分别为3.32、1.19、2.59。4.探针回收率考察结果表明TMP的回收率随着流速的增加呈降低趋势,FA的回收率在1.5 ul/min流速时略有增大,而后呈降低趋势,且RR与RL在各流速下均基本不变。并且在一定浓度范围内,FA、TMP的回收率与浓度及透析方法无关。当流速不变时,FA、TMP体内RL在约8h内保持相对稳定,具有良好的体内稳定性。5.川芎-天麻不同配比在血瘀型偏头痛大鼠体内TMP和FA药动学参数比较,TMP在5mmin时各给药组的药物浓度都较大,说明在各配比药对中TMP均可迅速的吸收进入动物体内。且1:0.25组、1:1组与单味药组比较Cmax、T1/2、AUC均有显著增加,且均具有显著性差异(P<O.05,P<0.01),且滞留时间MRT显著延长。1:0.25药对组与1:1药对组比较T1/2、MRT显著增大,且具有显著性差异(P<0.01)。各组中FA药动学参数比较,1:0.25组单味药组比较Cmax、T1/2、MRT显著增加,且均具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),1:1药对组和单味药组比较Cmax、T1/2、MRT显著增加,但T1/2、MRT均没有显著性差异。结论1.药效学实验研究部分,模型组与正常组观察指标具有显著性差异,血清及脑匀浆中各药对组和模型组比较NOS、CGRP、6-Keto-PGF1α含量均有所降低,初步证明了川芎-天麻配伍对治疗血瘀型偏头痛具有一定疗效,且4:1药对组效果显著优于1:4药对组。2.建立了一种可以同时测定微透析样品中川芎嗪和阿魏酸含量的UPLC-MS方法,该方法具有较高的专属性,杂质无干扰,各成分线性关系良好,定量下限、日内精密度与日内稳定性均达到生物样品的分析要求。因此,可用于川芎嗪和阿魏酸在大鼠体内的药动学研究。3.从体内和体外两方面对微透析回收率进行了比较全面的考察,实验表明,利用微透析技术研究川芎嗪和阿魏酸在偏头痛大鼠体内药动学研究切实、可行。4.各给药组药动学参数有显著性差异,各组AUC数据分析,1:0.25,1:1药对组相较于单味药都有所显著增大。说明天麻的加入改善了 FA/TMP体内的吸收,减缓了体内的消除,且1:0.25药对中FA/TMP消除最慢,滞留时间最长,吸收程度最大,进而说明了 1:0.25(即4:1)组方治疗血瘀型偏头痛的科学性和合理性。