宫内发育迟缓后发生胰岛素抵抗的分子机制

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【目的】1.探讨宫内发育迟缓(Intrauterine Growth Retardation, IUGR)大鼠在胚胎期和出生后Insulin/Fox01/Pdx1/MafA基因的表达。2.探讨宫内发育迟缓大鼠在胚胎期和出生后microRNA(miRNA)的表达。【方法】实验一:(1)妊娠全程食物限制法制备宫内发育迟缓大鼠模型:清洁级SD大鼠,雌雄鼠1:3合笼交配,孕鼠按受孕顺序随机分为两组(IUGR组和对照组)。IUGR组自妊娠第1天至分娩给予对照组饲料进食量的半量;对照组妊娠全程任意摄取饲料;(2)标本的采集:应用显微分离技术提取大鼠胚胎发育14.5天(E14.5),19.5天(E19.5)及新生大鼠胰腺组织;(3)胰腺组织形态学的观察:采用HE染色,光镜观察E14.5、E19.5及新生大鼠胰腺形态学变化;(4)大鼠胰腺发育相关基因表达的检测:使用RT-PCR技术检测胚胎发育E14.5、E19.5及新生大鼠胰腺Insulin/Fox01/Pdx1/MafA基因的表达情况;(5)不同时期大鼠胰腺Pdx1、MafA蛋白表达的检测:采用Western-blot方法检测胚胎发育E14.5、E19.5及新生大鼠胰腺Pdx1、MafA的蛋白表达情况。实验二:(1)妊娠全程食物限制法制备宫内发育迟缓大鼠模型:同实验一;(2)标本的采集:应用显微分离技术提取大鼠胚胎发育14.5天(E14.5),19.5天(E19.5)及新生大鼠胰腺组织并成功提取RNA;(3)miRNA的检测:采用丹麦Exiqon公司miRCURY. LNA miRNA表达谱芯片,对各样本RNA进行miRNA表达水平的检测;(4)芯片检测结果的验证:用实时定量PCR方法对选取的miRNA进行验证。【结果】实验一:(1)与对照组大鼠相比,IUGR组在胰腺发育E14.5、E19.5及新生时均有形态学上的改变,表现为组织松散,结构不清晰,胰岛数量及面积减少;(2)Insulin/Fox01/Pdx1/MafA基因全程均有表达;(3)Insulin、MafA基因随胎龄的增长表达量增多,与对照组相比,IUGR组Insulin基因表达无明显差异(P>0.05),而MafA基因表达较之减少(P<0.05);(4)Fox01、Pdx1基因均在胚胎早期表达较多,随胎龄的增长表达量下降,且与对照组相比,IUGR组Pdx1基因表达无明显差异(P>0.05),Fox01表达较对照组减少(P<0.05);(5)MafA蛋白随胎龄的增长表达量增多,且IUGR组表达明显低于对照组(P<0.05);Pdx1蛋白随胎龄的增长表达量减少,IUGR组与对照组表达无明显差异(P>0.05)。实验二:(1)宫内发育迟缓大鼠在胚胎期和新生后miRNA的表达:对照组中,E19.5与E14.5相比,上调的miRNA有48个,下调的28个;新生鼠与E14.5相比,上调的64个,下调55个;新生鼠与E19.5相比,上调40个,下调52个。同时,与对照组相比,IUGR组中E14.5上调的miRNA有10个,下调的有26个;E19.5上调22个,下调15个;新生鼠上调9个,下调13个;(2)对选取的miR-124、let-7d*验证:对照组中,miR-124在新生鼠均比E14.5、E19.5显著上调(FoldChange>=1.5),而IUGR组较对照组表达无明显差异(0.67<FoldChange
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