目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种以上、下运动神经元缺失及神经胶质细胞增生为特征的进行性神经系统变性疾病。上、下运动神经元的缺失可引起进行性骨骼肌无力、肌萎缩及腱反射亢进等临床表现。其中5-10%的ALS为家族性ALS(FALS),主要表现为常染色体显性遗传;90-95%的ALS无家族遗传特性,为散发性ALS(SALS)。该病缺乏有效的治疗手段,病人最终常因呼吸麻痹死亡。研究表明,在最终导致ALS的运动神经元死亡的不同生理机制中,氧化应激可能起中心作用。与其他器官相比,神经系统更易受到氧化损伤。铁作为人体必需的微量金属元素,参与体内的多种生物学过程。体内铁过量时可引起氧化应激导致细胞的凋亡及损伤,细胞内铁失衡是细胞内氧化损伤的一个重要原因。目前越来越多的证据提示铁稳态失衡在神经系统变性疾病的发生及发展中起作用,在多种神经退行性疾病中都存在着氧化应激和异常铁积聚的现象。铁过载导致的氧化应激在ALS的发病中可能发挥重要作用。中枢神经系统铁稳态失衡的机制并不十分明确,其中一种可能机制就是遗传性血色素沉着病基因即HFE基因缺陷。HFE基因是人们在研究遗传性血色素沉着病(hereditary hemochromatosis, HH)的候选基因的时候发现的,该基因主要参与体内铁代谢,位于人类6号染色体短臂,可编码产生由343个氨基酸构成的HFE蛋白。HFE蛋白主要分布于人体的消化道粘膜细胞,通过与转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1,TfR1)结合竞争性抑制细胞铁的吸收;同时也可通过与转铁蛋白受体2(Transferrin receptor 2,TfR2)结合,调节hepcidin在肝细胞的合成及分泌,从而调节铁在消化道的吸收。当编码HFE蛋白的HFE基因出现变异时,可导致蛋白结构的改变,从而使其失去抑制铁吸收的作用,导致铁在体内多种组织过量沉积而产生氧化损伤。HFE基因多态性主要表现为C282Y、H63D及S65C三种,HFE基因突变可能是ALS的一个危险因素。虽然有关HFE基因多态性与ALS之间相关性的研究国外已有报道,但是关于中国汉族人群HFE基因多态性与ALS之间相关性的研究较少见。本文利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性( polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法及DNA样本抽样测序的方法来明确中国汉族人群中HFE基因多态性,进而探讨中国汉族人群HFE基因多态性与ALS遗传易感性的关系,从分子水平为ALS的预防和诊治提供依据。方法:1研究对象:以124例SALS病人和210例健康人为研究对象。其中全部患者均根据世界神经病学联盟EI Escorial诊断标准进行诊断和鉴别诊断,均为散发病例。对照组为随机选取的与SALS病例组年龄、性别相匹配并且无直接血缘关系的来我院健康体检的个体,并且符合以下标准:①汉族;②无任何遗传倾向性疾病;③在取样当时均未诊断有各种肿瘤、心脑血管疾病、精神异常及其他重大的健康问题。采样根据“知情同意”的原则进行。2人血DNA提取:采集外周静脉血5ml,参照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取外周血白细胞DNA。3 C282Y、H63D及S65C基因型分析:对以上334个样本利用PCR技术与限制性内切酶技术分析C282Y、H63D及S65C突变情况。参照文献设计引物,进行HFE基因三个区域的PCR基因扩增,利用琼脂糖凝胶电泳进行产物鉴定。利用Rsa I(C282Y)、Mbo I(H63D)和Hinf I(S65C)限制性内切酶酶切,并经琼脂糖凝胶电泳进行检测。4 DNA样本抽样测序:随机抽取经RFLP-PCR检测后存在H63D突变的样本及正常H63D野生型样本各10份进行PCR扩增,并将扩增产物送上海生物技术有限公司进行测序,对基因多态性位点进行验证。5数据统计分析:采用SPSS 13.0版软件包(SPSS Company Chicago,Illinois,USA)进行处理。健康对照组与SALS组基因型频率分布行χ2检验做Hardy-Weinberg平衡分析。SALS组与健康对照组的年龄差异采用t检验,性别差异采用χ2检验。两组间的基因型与等位基因频率分布比较采用χ2检验,以非条件logistic回归方法计算表示相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)。P<0.05作为差异有显著性的标准。结果:1健康对照组及SALS组HFE基因型均符合Hardy-Weinberg平衡,说明健康对照组样本及SALS组均具有群体代表性。2 C282Y、H63D及S65C基因型分析:334个样本均未见C282Y及S65C突变情况。对HFE基因H63D基因型进行检测,334个样本中共发现24个H63D杂合突变,其中SALS组16例,健康对照组8例,余样本均为H63D野生型。健康对照组中H63D CG基因型频率为3.81%,G等位基因突变频率为1.90%;SALS组中H63D CG基因型频率为12.90%,G等位基因突变频率为6.45%。SALS组中CG基因型频率(12.90%)明显高于对照组(3.81%),两组间比较差异有显著性(P=0.02)。经非条件logistic回归方法分析CG基因型可增加患病风险(OR=3.74,95%CI=1.55- 9.02)。3在以疾病首发部位、病程分层、首发年龄分层和性别分层后,H63D CG基因型在各亚组间分布无差别(分别为P=0.612、P=0.677、P=0.915、P=0.626)。4测序结果:酶切后提示存在H63D杂合突变的样本经测序显示存在C→G突变,并且均为杂合突变,该结果与酶切结果一致。酶切后提示无H63D突变的10个样本的测序结果提示均为CC型纯合子。结论:1中国汉族人群存在HFE基因H63D多态性。携带HFE基因H63D CG基因型可能增加SALS的发病危险性。因此,H63D突变可能是SALS的潜在危险因素。2中国汉族人群HFE基因不存在C282Y及S65C多态性,在中国汉族人群内两种基因型可能与SALS的发生无明显相关性。3未发现HFE基因H63D多态性与SALS的首发部位、病程、首发年龄和性别有明显相关性。