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过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)辅助激活因子1α(PPARγcoactivator-1α,PGC-1α)是一个重要的能量调节因子,不仅能调控生命活动基本的代谢活动如脂质和糖类的代谢,同时也能调节线粒体的生物合成并行使正常的功能。PGC-1α的分布范围十分广泛,在(brown adipose tissue,BAT)褐色脂肪组织、心脏、大脑、肝脏、肌肉等多个组织中均能检测到其表达,且在不同类型组织中具有不同的表达量。PGC-1α基因的结构包含C端的转录激活域、中间的转录抑制域、一个富含丝氨酸及精氨酸残基的模体结构以及N端的RNA结合域。作为一个参与各个生理生化过程的关键调控分子,PGC-1α被认为是机体或细胞外部信号的主要感受器。它能被诸多因素激活:1.活性氧类和活性氮类物质(ROS)和(RNS)。这两者均为细胞内源性的代谢副产物,当细胞受到应激时,上述两种活性物质的含量均上升;2.低温诱导。当机体暴露在冷环境中,PGC-1α的表达量显著性上升,通过促进机体的适应性产热以适应低温环境造成的影响;3.锻炼、长时间的耐力型训练均能引起PGC-1α的表达量升高。此外还有多种重要的信号通路参与调控PGC-1α的转录和表达。PGC-1α最初被发现是由于其在寒冷暴露下,在棕色脂肪中作为一个冷诱导调控因子能增加适应性产热。哺乳动物暴露在寒冷环境中,其作为恒温动物主要通过骨骼肌颤栗、增加有氧呼吸产生ATP和热量以维持低温下正常的生理活动;当植物暴露于寒冷环境中,蛋白质和核酸构象发生改变、细胞膜的流动性降低,主要通过增加冷诱导蛋白的表达量从而引起下游信号通路以适应低温。关于PGC-1α在机体受到低温刺激过程中所起作用的相关的研究主要集中于哺乳动物模型,而其功能在鱼类中鲜有报道。因此本研究以斑马鱼胚胎成纤维细胞ZF4细胞为实验模型,通过构建慢病毒载体并转染ZF4细胞,以干扰细胞内源性的PGC-1α的表达量;并利用嘌呤霉素筛选获得PGC-1α敲降的稳转细胞系,并给与其18°C、10°C不同程度和不同时间的低温刺激,以探究PGC-1α在ZF4冷应激过程中所起的功能。野生型的斑马鱼ZF4细胞18°C 1~7 d的低温处理后,PGC-1α的mRNA表达量较28°C正常温度下生长的细胞显著性上升。以上证实低温刺激诱导ZF4细胞内PGC-1α的表达量升高。为探究低温刺激下PGC-1α对ZF4细胞所起的功能,本研究根据NCBI网站上斑马鱼PGC-1α基因的编码区序列设计了PGC-1α的4个shRNA:分别对应其CDS区第165、457、1486、2487位碱基起始长度为21 bp的片段。转染慢病毒质粒后,ZF4细胞中PGC-1α的表达量进行检测发现,4个敲降位点对应的敲降比例分别为43%、38%、25%和50%,故选择转染PGC-1α-shRNA4的细胞作为后续的实验组。本研究分为三组:空白对照组(pLKO.DEST.EGFP)、阴性对照组(pLKO.1-shNC)和实验组(pLKO.1-shRNA)。将以上三组细胞分别在18°C和10°C处理1d、4d、7d后用,通过CM-H2DCFDA探针染色后流式细胞仪检测对照组、PGC-1α-shNC和PGC-1α-sh4三组细胞内的ROS水平发现,在28°C时,PGC-1α敲降不影响细胞内ROS的含量;而给予ZF4细胞18°C不同时间的低温刺激后,PGC-1α敲降组(PGC-1α-sh4)细胞内的ROS含量高于空白对照组和阴性对照组:18°C 1 d(0.93±0.03 vs 0.79±0.03,p<0.001)、18°C4 d(2.10±0.15 vs 1.24±0.06,p<0.01)和18°C 7 d(4.00±0.16 vs 2.87±0.15,p<0.01)。ZF4细胞10°C处理1 d、4 d、7 d后,ROS的表达量增加并且随着冷处理时间的延长,ROS在细胞内有累积的趋势。这也从侧面反应在低温刺激下,PGC-1α能使体内ROS含量维持在相对稳定的水平范围内,从而减缓低温下产生的ROS对细胞造成的损伤。线粒体有氧呼吸伴随着ROS的产生,如果ROS在细胞内大量的积累,那么首先会危害到产生ROS的场所——线粒体。因此,我们又采用JC-1染色,通过BD C6流式细胞仪检测到PGC-1α敲降后的ZF4细胞经冷处理后其线粒体膜电位(MMP)发生显著性降低。正常情况下,膜电位正常的细胞占所有细胞的99%以上,而低温处理后,细胞的膜电位会发生一定程度的下降,PGC-1α敲除后细胞的膜电位下降加剧。同时,PGC-1α敲降的细胞在MMP下降后继而导致细胞发生凋亡的现象,其中早期凋亡的细胞所占的比例较PGC-1α未敲除的细胞显著性上升。另一方面,bax(促进细胞发生凋亡的蛋白)和bcl-2(抵抗细胞凋亡发生的蛋白)两者的比率在PGC-1α敲降的细胞中显著性减小,bax的蛋白水平显著性升高,与之相反bcl-2的蛋白水平显著性降低,说明PGC-1α敲降后给予ZF4细胞低温刺激继而引发细胞凋亡。综上所述,冷应激过程中PGC-1α的敲降会引起细胞内ROS水平升高,线粒体中MMP下降,bax蛋白的表达升高而bcl-2的表达降低,引发内源性的由线粒体为中心而引发的细胞凋亡通路。这也从另一个角度证明了PGC-1α在ZF4细胞受到冷刺激后能保护其免受低温的危害,能通过维持ZF4细胞内的ROS水平和MMP以适应冷应激产生的一系列应答反应。