论文部分内容阅读
目的：COPS3(COP9 signalosome complex subunit3,CSN3)基因是COP9信号复合体(COP9 signalosome complex)的第三个亚基,位于人类17号染色体。近年来的研究发现染色体17p的扩增与p53位点的杂合子丢失、p53等位基因缺失与恶性肿瘤的发生发展有密切关系。已有研究表明,高度恶性骨肿瘤样本中可以检测到COPS3扩增及过表达。而目前尚未有COPS3基因是否参与肝癌发生的报道。本研究探讨COPS3基因在肝癌发生和发展中的作用。 方法：采用免疫组化法,检测30例肝癌组织和30例肝硬化组织中COPS3蛋白的表达水平和细胞内定位。采用RNA干扰技术,设计COPS3基因靶向小干扰RNA序列,构建小发夹RNA(shRNA),重组含有COPS3 shRNA的慢病毒表达载体,与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度并通过Western Blot方法验证有效的siRNA靶序列。选择最佳的siRNA序列,包装慢病毒感染SMMC-7721和Hep3B肝癌细胞,进行体外MTT、BrdU、克隆形成、细胞周期、细胞凋亡检测,并建立肝癌移植小鼠模型,进行成瘤实验。为进一步探讨COPS3在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用,利用Western Blot方法检测凋亡相关蛋白表达,初步探讨COPS3基因调节肝癌细胞增殖的分子机制。 结果：免疫组化结果表明,COPS3蛋白在肝癌组织中和肝硬化组织中的表达高于正常肝组织,且肝癌组织中的表达显著高于肝硬化组织;COPS3蛋白在癌变的肝组织中主要定位于细胞核,而在正常肝组织中主要定位于细胞浆。为探讨COPS3基因在肝癌细胞生长中的作用,设计COPS3靶向shRNA序列,包装成滴度为2×108TU/ml慢病毒,有效感染SMMC-7721和Hep3B肝癌细胞,并在mRNA和蛋白水平下调肝癌细胞COPS3的表达。COPS3沉默导致肝癌细胞活力,DNA合成水平、克隆形成能力显著降低,并引起细胞周期阻滞于G0/G1期,同时诱导肝癌细胞凋亡。COPS3沉默还可导致裸鼠体内肝癌移植瘤的生长减缓。此外,COPS3下调的肝癌细胞中,凋亡分子Caspase8、BIK的表达上调、PARP蛋白发生裂解。 结论：COPS3在肝癌组织中表达水平和定位均发生改变,可能参与肝癌的发生和发展过程。COPS3沉默(COPS3 shRNA)可诱导肝癌细胞周期阻滞、调节Caspase8、PARP和BIK的活性,促进肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖,结果提示COPS3基因是促进肝癌细胞生长的癌基因之一。