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目 的: 为了更深入地了解番茄叶(草本植物番茄 Lycopersicon esculentum Mill的叶子)的化学成分及其抗氧化、抑菌、抗肿瘤效果,为番茄叶的研究工作提供更多的参考数据。 方 法: (1)采用紫外分光光度法,以芦丁标准品为对照品,对番茄叶 50%乙醇提取浸膏中的总黄酮含量进行测定,考察影响番茄叶浸膏的提取效果的因素(提取部位、提取时间、溶剂浓度、溶剂体积、提取方法)并进行优选,从而对番茄叶不同浓度浸膏乙醇溶液中的总黄酮含量进行测定。 (2)采用冷浸提取法、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、半制备液相色谱等方法对番茄叶 30%乙醇部位的有效化学成分进行分离纯化,对所得的单体物质进行鉴定。 (3)采用高效液相色谱法进行含量测定,以芦丁标准品为对照品,以番茄叶中所含成分芦丁含量为评价指标,单因素考察对影响番茄叶的提取效果的诸因素进行优选,并在最佳工艺下,进行方法学考察。 (4)比较番茄茎、叶粗提物以及番茄叶各水-乙醇梯度的体外抗氧化能力。利用普鲁士蓝法考察其总还原能力,邻苯三酚自氧化法考察超氧阴离子自由基的清除能力以及邻二氮菲比色法测定羟自由基的清除能力。 (5)用不同浓度的番茄叶提取物作用于体外培养的人肺癌NCI-H460细胞、人宫颈癌Hela细胞、人肝癌SMMC-7721细胞,显微镜下观察细胞形态和生长情况,并采用CCK-8法检测药物对肿瘤细胞增殖抑制作用,再用番茄叶 30%乙醇部位分离得到的芦丁和槲皮素对抑制效果最好的人肺癌NCI-H460细胞进行测定;以人肺癌NCI-H460细胞为模型,运用吖啶橙/溴化乙啶双荧光染色法观察细胞凋亡形态;应用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。 (6)测定番茄叶提取物对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度,用牛津杯法测试加了番茄叶提取物后的菌种抑菌圈。 结 果: (1)优选番茄叶浸膏中总黄酮的提取方法,结果显示选用95%乙醇,物料比为20∶1,超声提取1h时的总黄酮含量最高。番茄叶中不同浓度浸膏乙醇溶液提取物中的总黄酮含量水浸膏、30%乙醇提取浸膏、50%乙醇提取浸膏、70%乙醇提取浸膏、95%乙醇提取浸膏分别为33.946mg/g、158.95mg/g、60.107mg/g、1.0994mg/g、1.5692mg/g,结果显示30%乙醇浸膏的总黄酮含量最高。 (2)优选番茄叶中芦丁的提取方法及含量测定方法,结果显示选用80%乙醇,物料比为40∶1时,回流提取1h的芦丁含量最高。 (3)①番茄叶粗提取物的超氧阴离子清除能力比茎粗提取物强,以95%乙醇粗提取物的清除能力强于75%乙醇粗提取物。 ②番茄叶粗提取物对羟自由基清除能力比茎粗提取物强,不同溶剂的清除能力由强到弱为95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇。番茄叶不同浓度乙醇浸膏对羟自由基清除能力不同,其中30%乙醇部位、50%乙醇部位、95%乙醇部位羟自由基清除能力较强。 ②番茄叶粗提取物的还原能力比茎粗提取物强,以75%乙醇、50%乙醇为溶剂的提取液的还原能力相近,且都强于以95%乙醇为溶剂的提取液。番茄叶不同浓度乙醇浸膏的还原能力从30%乙醇部位到95%乙醇部位还原能力逐渐减弱番茄叶粗提取物抗氧化活性均比番茄茎粗提取物的强。番茄叶95%乙醇浸膏的超氧阴离子清除能力和羟自由基清除能力最强,还原能力从30%乙醇部位到95%乙醇部位还原能力逐渐减弱。 (4)实验表明不同浓度的番茄叶提取物对人肺癌NCI-H460细胞、人宫颈癌Hela、人肝癌SMMC-7721 三种癌细胞均有不同程度的抑制作用,而且与时间长短和剂量大小具有相关性。其中最为敏感的细胞株有人肺癌H460细胞,抑制增值效果显著(P<0.05)。番茄叶30%乙醇部位分离得到的槲皮素和芦丁对人肺癌NCI-H460细胞均有很好的抑制效果,槲皮素的半数抑制率如下:24 h的IC50值为50.6μg/ml,芦丁的半数抑制率如下:24 h的IC50值为91.45μg/ml。AO/EB在荧光显微镜下观察到给药组的肿瘤细胞的形态发生明显改变,出现凋亡小体及细胞质碎片,Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡率显著增加(P<0.05),经高中低剂量处理24h后,细胞凋亡率分别为:(7.42±0.07)%、(17.36±0.25)%、(42.90±0.56)%,与剂量大小具有相关性,这两种方法从定性定量两方面说明了番茄叶提取物诱导了人肺癌H460细胞发生凋亡。 (5)实验表明番茄叶提取物对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用,番茄叶提取物对大肠杆菌的最小杀菌浓度和最小抑菌浓度为6.25mg/ml时,对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度和最小抑菌浓度为3.125mg/ml。番茄叶提取物抑菌能力受浓度的影响显著,浓度越低,抑菌能力减弱的越明显。 结 论: (1)番茄叶30%乙醇部位的黄酮含量最高,而且具有较强的抗氧化活性。 (2)从番茄叶 30%乙醇部位分离得到了4 个化合物,鉴定了 β-谷甾醇、α-菠甾醇、槲皮素、芦丁。 (3)优选番茄叶中芦丁的提取工艺及含量测定方法,结果显示提取时间为2h,溶剂为80%乙醇,物料比为40:1时,进行回流提取的芦丁含量最高。 (4)番茄叶粗提取物抗氧化活性均比番茄茎粗提取物的强。番茄叶 95%乙醇浸膏的超氧阴离子清除能力和羟自由基清除能力最强,还原能力从 30%乙醇部位到 95%乙醇部位还原能力逐渐减弱。 (5)番茄叶提取物能够抑制人肺癌NCI-H460细胞、人宫颈癌Hela细胞,人肝癌SMMC-7721细胞的增殖,并且具有浓度-时间依赖性,且对人肺癌 NCI-H460 细胞抑制效果最明显。番茄叶30%乙醇部位分离得到的芦丁和槲皮素对人肺癌NCI-H460细胞均有明显的抑制效果。 (6)番茄叶提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显。