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巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞。一般认为,来源于骨髓造血干细胞分化的单核细胞首先进入血液循环,在机体生理和病理情况下,血液中的单核细胞被招募到组织中,进一步分化成组织中的成熟巨噬细胞。巨噬细胞承担着噬菌、杀菌、清除机体内损伤和衰老细胞、参与组织发育和修复以及传递抗原信息等作用,其异常活化还与机体炎症的发生发展密切相关。激活素受体相互作用蛋白(Activin receptor-interacting proteins,ARIPs)属于细胞内激活素信号传导蛋白,ARIPs家族蛋白存在明显的组织学分布和生物作用的差异。研究室前期研究发现ARIP1主要表达在神经组织的大脑皮质小细胞神经元,ARIP2主要表达在大脑皮质大细胞神经元、心脏、肝脏、肺及胰岛等组织,小鼠腹腔巨噬细胞也证实有ARIP2 m RNA表达;而下丘脑神经元及小脑浦肯野细胞既表达ARIP1也表达ARIP2。但是,ARIP1能否在巨噬细胞表达,以及ARIP1及ARIP2在巨噬细胞的作用是否存在差异,仍不清楚。因此,本研究首先确定ARIP1及ARIP2在小鼠单核巨噬细胞的表达情况,并进一步分析二者在LPS活化巨噬细胞中的作用及其机制差异。1研究方法1.1 ARIP1和ARIP2在巨噬细胞表达分析RT-PCR和免疫细胞化学染色检测单核巨噬细胞系Raw264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞ARIP1和ARIP2的表达。1.2骨髓来源单核巨噬细胞的分化诱导分离小鼠股骨的骨髓细胞,采用GM-CSF体外诱导骨髓造血干细胞分化。1.3 ARIP1和ARIP2基因过表达实验1.3.1体外过表达采用对照空质粒pc DNA3(PC)和表达质粒pc DNA3-ARIP1(ARIP1)或pc DNA3-ARIP2(ARIP2)分别转染RAW264.7细胞,利用RT-PCR和免疫细胞化学染色等方法鉴定表达效率。1.3.2体内过表达Balb/c纯系小鼠,随机分为PC、ARIP1和ARIP2组,分别于每只小鼠腹腔注射PBS 2ml,2h后每只小鼠分别注射相应3μg质粒和转染试剂混合物,12h后分离小鼠腹腔巨噬细胞,RT-PCR和免疫细胞化学染色鉴定表达效率。2研究结果2.1 ARIP1及ARIP2在单核巨噬细胞的表达RT-PCR和免疫细胞化学染色结果显示ARIP1和ARIP2在小鼠腹腔巨噬细胞及单核巨噬细胞系Raw264.7细胞中均有表达。2.2 ARIP1表达与单核巨噬细胞分化2.2.1 ARIP1在造血干细胞来源的单核巨噬细胞的表达为了确定ARIP1及ARIP2在单核巨噬细胞的表达是否与其分化有关,研究采用RT-PCR检测了骨髓造血干细胞和基质干细胞ARIP1及ARIP2表达情况。结果显示骨髓造血干细胞和基质干细胞均不表达ARIP1,而表达ARIP2及Smad3等分子。进一步的研究显示,GM-CSF诱导造血干细胞来源的单核巨噬细胞不仅表达ARIP1 m RNA,也表达ARIP1蛋白。2.2.2 ARIP1过表达对Raw264.7细胞成熟分化的影响研究报道在诱导因子作用下,单核巨噬细胞系Raw264.7细胞可以向成熟巨噬细胞分化。因此,研究采用吉姆萨染色观察Raw264.7细胞形态学变化,结果显示,ARIP1过表达后Raw264.7细胞呈现多边形的成熟样巨噬细胞形态变化,而ARIP2过表达对Raw264.7细胞形态没有明显影响,提示ARIP1可能促进了单核巨噬细胞向成熟分化,而ARIP2表达可能与单核巨噬细胞分化无关。2.2.3 ARIP1过表达对巨噬细胞吞噬活性的影响成熟巨噬细胞具有较强的吞噬活性。流式细胞术结果显示,ARIP1过表达Raw264.7细胞吞噬能力与PC组相比明显增强;ARIP1过表达小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力与PC组相比也明显增强。2.2.4 ARIP1过表达对巨噬细胞表面分子CD14表达的影响流式细胞术检测过表达后巨噬细胞表面分子CD14的变化,结果显示ARIP1过表达促进Raw264.7细胞表面分子CD14表达,进一步表明RAW264.7细胞向成熟样巨噬细胞分化。2.3 ARIP1和ARIP2对LPS活化巨噬细胞活性的影响2.3.1 LPS活化巨噬细胞ARIP1和ARIP2的表达为了确定ARIP1及ARIP2表达与巨噬细胞活性的关系,实验采用RT-PCR和免疫细胞化学染色检测了LPS活化巨噬细胞ARIP1及ARIP2表达情况。结果显示不同浓度的LPS(0.2μg/m L和0.5μg/m L)刺激后,ARIP1和ARIP2表达均增加,并具有剂量依赖性。2.3.2 ARIP1和ARIP2过表达对巨噬细胞吞噬活性的影响在LPS活化的巨噬细胞中,ARIP1过表达促进巨噬细胞吞噬荧光颗粒;ARIP2过表达则抑制巨噬细胞的吞噬活性。2.3.3 ARIP1和ARIP2过表达对巨噬细胞IL-1β及TNFα产生的影响LPS活化巨噬细胞后,ELISA法检测细胞培养上清NO、IL-1β及TNFα水平,结果显示ARIP1或ARIP2过表达均可降低IL-1β和TNFα的产生,但对NO分泌无明显影响。2.3.4 ARIP1和ARIP2体内过表达对巨噬细胞IL-1β及TNFα产生的影响小鼠腹腔巨噬细胞体内过表达ARIP1和ARIP2后,ELISA法检测腹腔液中IL-1β及TNFα水平,结果显示ARIP1或ARIP2过表达组与PC组相比,腹腔液中IL-1β和TNFα水平均降低。LPS体外刺激ARIP1和ARIP2体内过表达小鼠腹腔巨噬细胞,结果显示ARIP1或ARIP2过表达组与PC组相比,IL-1β和TNFα产生水平均降低。2.4 ARIP1和ARIP2过表达对巨噬细胞信号分子及表面分子表达的影响2.4.1 ARIP1及ARIP2过表达对NF-κBp65及Smad3表达的影响Western blotting结果显示ARIP1过表达下调NF-κBp65及Smad3蛋白水平,而ARIP2过表达对NF-κBp65及Smad3蛋白水平没有明显影响。2.4.2 ARIP1及ARIP2过表达对细胞表面分子表达的影响流式细胞术检测结果显示ARIP1及ARIP2过表达对巨噬细胞表面TLR2和TLR4表达没有明显影响;ARIP1过表达可以促进CD14表达,而ARIP2过表达则下调CD14分子的表达。3结论综上所述,ARIP1在单核巨噬细胞系Raw264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞,以及GM-CSF诱导的造血干细胞来源单核巨噬细胞均表达,ARIP1过表达促进巨噬细胞向成熟样分化,并增强巨噬细胞吞噬活性,上调巨噬细胞表面分子CD14表达,提示ARIP1不仅在神经细胞表达,在单核巨噬细胞也表达,其表达可能与单核巨噬细胞分化成熟有关。因此,ARIP1有可能成为新的单核巨噬细胞分化成熟的生物标志物。ARIP2虽然也在单核巨噬细胞表达,但其表达和单核巨噬细胞分化无明显关联。研究还发现LPS可以促进ARIP1和ARIP2在巨噬细胞的表达,ARIP1和ARIP2过表达均可降低LPS活化巨噬细胞炎性细胞因子IL-1β及TNFα产生,提示二者可能具有抗炎作用。研究还显示,ARIP1过表达下调NF-κB p65及Smad3表达,而ARIP2过表达不影响NF-κB p65及Smad3表达,但明显下调CD14表达,该结果表明,ARIP1和ARIP2虽然均在巨噬细胞表达,但二者的作用机制不同。