第一部分脓毒症3.0精确性和实用性验证目的:对脓毒症3.0(Sepsis 3.0)诊断标准的精确性进行临床验证,以指导和推广其临床应用。方法:采用多中心回顾性研究方法,选择2015年1月至6月浙江省6家三甲医院重症加强治疗病房(ICU)收治的患者,筛选出符合Sepsis2.0和Sepsis3.0诊断标准者,比较符合两个版本指南患者的人群特征,并按照医院进行分组,观察不同级别医院诊断率的差异。根据医生诊断情况,将符合Sepsis 2.0诊断标准的患者分为诊断组和非诊断组,采用logistic回归分析影响医生诊断脓毒症的相关因素。将符合Sepsis 2.0但不符合Sepsis 3.0的患者作为排除组,同时符合Sepsis 3.0的患者作为入选组,比较两组患者的基本特征。绘制受试者工作特征曲线(ROC),分析全身炎症反应综合征评分(SIRS)、脓毒症序贯器官衰竭快速评分(qSOFA)、序贯器官衰竭评分(SOFA)对患者死亡的预测价值,并对比分析qSOFA与SOFA的一致性是否会影响诊断的敏感度。将Sepsis2.0患者分为死亡组和存活组,采用logistic回归分析与死亡相关的因素。结果:共收治1 423例患者,符合Sepsis 2.0和Sepsis 3.0诊断标准者分别为363例和329例两组患者人群特征比较,除急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分有显著差异(分:19.10(8.00)比 20.28(8.00),P<0.05]外,其余指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。对各医院分析显示,医院3的患者28 d病死率最高(分别为60.4%、60.0%),诊断率最低(为0);而医院1的患者28 d病死率最低(分别为22.9%、27.2%),诊断率为19.5%;而诊断率高达44.8%的医院4的28 d病死率却均达58.6%。Logistic回归分析显示,年龄大[优势比(OR)=0.97,P = 0.02)、乳酸高(OR=0.44,P=0.00)、血压高(OR=0.96,P=0.01)、氧合指数低(OR=1.00,P = 0.02)的患者更容易被忽视诊断。与Sepsis 3.0入选组比较,Sepsis 3.0排除组患者年龄更小[岁:53.75(18.00)比68.52(26.00),P<0.05]APACHEⅡ 评分更低[分:7.72(6.00)比 20.38(8.00),P<0.05),乳酸值更低(mmol/L:1.95(1.20)比 3.45(3.00),但 P>0.05],ICU住院时间更短[d:15.13(16.00)比 22.42(22.00),P<0.05],28 d 病死率更低[13.90(5)比 45.29(149),P<0.05],说明Sepsis3.0特异度更高,且Sepsis3.0患者预后更差。ROC曲线分析显示,SIRS、qSOFA、SOFA对预测死亡的诊断价值依次升高[ROC曲线下面积(AUC)分别为0.57、0.60、0.69,均P<0.05)。将Sepsis2.0中符合qSOFA和(或)SOFA的两组患者进行比较,结果显示,两组APACHEⅡ评分[分:17.55(7.00)比 23.24(8.00))和 28d 病死率[38.80%(31)比58.60%(75)]存在统计学差异(均P<0.01),即使只满足qSOFA的患者28 d病死率也高达38.80%,提示在临床工作中,即使只有qSOFA出现异常也应引起足够的重视。与存活组比较,死亡组患者年龄更大,APACHEⅡ评分更高,ICU住院时间较短(均P<0.05);logistic回归分析显示,与死亡相关的因素有APACHEⅡ评分(OR=1.20,P = 0.00)和 ICU 住院时间(OR=0.95,P=0.00)。结论:Sepsis 3.0筛选出的患者倾向于器官功能障碍,对死亡的预测价值较Sepsis 2.0更高,且诊断特异度提高,但数据显示仍然有改进空间。第二部分辛伐他汀不同剂型对脓毒症EC与SMC共培养模型的保护作用及机制研究目的:本研究主要探索辛伐他汀对于LPS诱导的脓毒症模型对EC及SMC的保护作用及其可能的分子机制,并改进药物剂型,通过纳米粒制剂,提高药物的药效,减低毒副作用。方法:(1)用LPS诱导,建立内皮细胞脓毒症细胞模型,观察EC凋亡情况。使用辛伐他汀纳米粒及普通静脉制剂处理细胞,研究辛伐他汀的抗凋亡作用。按分组处理EC,观察EC中eNOS、磷酸化AKT、AKT蛋白的表达情况。探究辛伐他汀对于细胞内eNOS的调节作用及可能机制。(2)用LPS诱导,SMC及EC建立脓毒症细胞模型,并通过单独培养及共培养方式,模拟脓毒症时单核/巨噬细胞释放炎症因子,对于血管内皮的作用。使用辛伐他汀纳米粒及普通静脉制剂处理细胞,研究辛伐他汀的抗炎作用及对血管可能的保护作用及其机制(3)首先使用siRNA干扰IQGAP1蛋白在SMC中的表达,验证其在脓毒血症过程中细胞迁移过程中发挥作用,再对EC及SMC分组处理,通过transwell实验,检测SMC单独培养及EC共培养作用下的迁移能力变化,研究辛伐他汀对血管迁移可能的影响及其机制。(4)使用人工合成的PDGF刺激SMC,验证其在细胞迁移过程中PDGF对IQGAP1蛋白mRNA表达的正反馈作用并对细胞的迁移能力产生影响,随后再对细胞按分组处理后,通过QPCR实验检测EC在脓毒症情况下是如何通过PDGF对SMC进行调节,并研究辛伐他汀对这一过程可能的影响及其机制。结果:(1)LPS处理EC24h后,早期凋亡较对照组明显增加。而辛伐他汀纳米粒组(LPS+辛伐他汀纳米粒)与辛伐他汀静脉组(LPS+辛伐他汀静脉组)能够减轻由LPS所引起的细胞凋亡。辛伐他汀还通过AKT通路升高内皮细胞的eNOS含量来改善脓毒症的炎症环境。(2)在抗炎方面,辛伐他汀对EC的IL-6释放量升高的无明显影响,但共培养组的IL-6释放量皆低于单独培养组。而在SMC中,辛伐他汀能够显著的降低LPS所引起的炎症因子释放。在共同培养的情况下,同EC相似,炎症因子的释放也均低于单独培养的细胞,而对于肿瘤杀伤因子αα(TNF-α),辛伐他汀可以降低单独培养EC中由LPS诱导产生的TNF-α释放量,相对静脉制剂组,纳米粒组对TNF-α的抑制作用更佳。共培养体系中,仅有LPS组与单独培养组存在统计学差异。(3)在迁移方面,transwell结果显示:辛伐他汀可以通过改变SMC内的IQGAP1蛋白的表达量来降低由LPS所引起的细胞迁移能力增强,而EC内辛伐他汀可以调控EC内的PDGF的产生来达到改变SMC迁移能力的作用。结论:(1)辛伐他汀能够抑制SMC中IL-6炎性因子的释放量,抑制EC中TNF-α炎性因子的释放。(2)辛伐他汀能够阻遏EC的凋亡,从而可能维持了血管上皮的完整性。我们从细胞学western blot结果得出,辛伐他汀能够激活PI3K/AKT通路来促进eNOS的表达,从而保持了细胞内eNOS的平衡,对在脓毒症的病理发展中eNOS表达量降低的起到一定的阻遏作用。(3)辛伐他汀能够抑制SMC与EC的迁移,从而可能维持了血管上皮的正常功能。(4)纳米粒作为新型载药制剂,在我们的实验中,其对降低EC中PDGF的表达、抑制磷酸化AKT蛋白表达的效果明显优于静脉制剂。