第二信使c-di-GMP在蜡样芽孢杆菌0-9中的作用研究

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环二鸟苷酸(c-di-GMP)是近年来在微生物体内新发现的一种具有第二信使作用的分子,在原核细胞内广泛存在。其代谢分别由具有GGDEF结构域并表现出二鸟苷酸环化酶(DGC)活性的蛋白催化合成,由具有EAL/HD-GYP结构域并表现出磷酸二酯酶(PDE)活性蛋白所降解;某些代谢c-di-GMP的蛋白还具有GGDEF-EAL串联的结构;另外,还有其它一些结构,如PAS结构域、PAC结构域、跨膜区等,共同来控制c-di-GMP的合成或者降解。原核生物中,GGDEF和EAL结构域分布广泛,其数量和种类的差异在不同种类细菌中差别明显,一般是革兰氏阴性菌中的数量比阳性菌中多。研究发现,c-di-GMP参与细菌多种生理功能,比如它可以调节菌体的生活方式从浮游状态转变为固着状态,调控细胞的分化,控制细胞毒力及生物薄膜的形成等方面。目前对第二信使c-di-GMP的研究主要集中在沙门氏菌(Salmonella.spp),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)等革兰氏阴性菌中,而在蜡样芽孢杆菌中有关c-di-GMP作用及信号传导机制的研究还未见报道。本研究中,为了确定蜡样芽孢杆菌0-9中是否存在控制第二信使c-di-GMP代谢的酶,通过生物信息学手段对0-9基因组DNA进行了分析,并将分析得到的基因在0-9中进行敲除,共构建了11株基因缺失菌株。对11株基因缺失菌株进行不同表型的测定,初步了解了这11个基因在蜡样芽孢杆菌0-9中的作用。在本研究中通过提取0-9基因组并对其进行重测序得到了0-9菌株的全基因组序列,利用基因序列分析软件DNAman,Primer Premier5.0,蛋白质分析软件SMART等生物信息学分析软件,对0-9的基因序列进行分析比对,生物信息学分析结果显示,蜡样芽孢杆菌0-9中,存在有11个基因:dgc1,dgc3,dgc4,dgc5,dgc6,dgc7,dgc12,dgc14,dgc16,dgc19和eal可能参与c-di-GMP的代谢,其中dgc1,dgc3,dgc16,dgc19含有GGDEF结构域,eal含有EAL结构域,其余8个基因的编码产物为同时具有GGDEF和EAL串联结构。为了系统分析蜡样芽孢杆菌中c-di-GMP的生理学作用,本研究利用分子生物学手段构建出这11个基因的基因缺失菌株,并对这11株基因缺失菌株与0-9野生型在生长情况,胞外多糖产生,胞外酶产生,对维生素K(一种抗氧化剂)耐受性,运动性及生物薄膜形成,总蛋白产生情况,等方面进行比较发现,在所测定的每种表型中,均有不同或者相同的基因缺失菌株表现出与0-9野生型之间的差异性。在胞外多糖产生方面,dgc1,dgc3基因的缺失使其在考马斯亮蓝G250平板上长出的菌落比0-9野生型致密,且颜色较深,菌落表面没有褶皱;dgc14,dgc19基因的缺失使菌落表面较湿润,颜色比0-9野生型稍深。dgc12基因缺失后,菌株产生胞外蛋白酶的能力下降;dgc1,dgc3基因缺失后,菌株产生溶血酶的能力弱于0-9野生型。在对0-9野生型菌株及其衍生菌株进行氧化胁迫测定时发现,一定浓度的维生素K会对0-9的生长起到抑制作用。当野生型0-9中的dgc-19基因缺失后,与野生型0-9相比,对氧化胁迫的敏感性增强;而当dgc1,dgc3,dgc5,dgc6,dgc7,dgc12,dgc14,dgc16基因缺失后,与野生型0-9相比,对氧化胁迫的敏感性降低。dgc1,dgc3,dgc12基因缺失后,菌株的运动能力较野生型0-9明显下降,运动能力减弱。而在生物薄膜形成方面,0-9(?dgc1)、0-9(?dgc3)、0-9(?dgc12)菌株产生的生物薄膜的情况要多于0-9,0-9(?dgc14)、0-9(?eal)产生的生物薄膜少于0-9,。在每个基因缺失菌株的总蛋白产生方面也有一定的不同,在24kDa和39kDa处差别最为明显。这些研究结果为以后研究与c-di-GMP代谢有关酶的每个基因的作用机制,c-di-GMP在蜡样芽孢杆菌0-9中的信号传导机制以及0-9在发挥生物防治作用时与c-di-GMP之间的关系奠定了基础。
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