尿液的收集储存和定期排出依赖于膀胱和尿道的协调活动,这一看似简单的过程却由一系列极其复杂的神经反射调控。大脑、脑干、脊髓和周围神经节通过盆神经、腹下神经和阴部神经构成多级调控系统协调下尿路活动。与其它内脏器官相比,下尿路的活动有以下特点：(1)其活动完全依赖中枢神经系统调控；(2)因为膀胱只有储尿和排尿两种功能状态,参与调控的神经环路多为开关式或位相性；(3)下尿路活动也在高级中枢的随意控制下进行。鉴于下尿路神经控制的复杂性,各种损伤、病变或化学刺激均可导致下尿路功能障碍,如膀胱过度活动,尿潴留、神经源性膀胱或逼尿肌括约肌不协调等。而通过干预特定外周神经活动,兴奋或阻断其信号传导,则可能达到改善下尿路功能障碍的目的。本课题通过以下两部分内容研究调控外周神经活动在下尿路功能障碍治疗中的作用及其机制：(1)μ,1(和δ型阿片类受体在胫神经电刺激抑制膀胱过度活动中的作用；(2)不同温度状态对阴部神经传导的影响,并探索安全有效且简便易行的方法阻断神经传导。第一部分μ,K和δ型阿片类受体在胫神经电刺激抑制膀胱过度活动中的作用前言：膀胱过度活动症(0AB)是一种极为常见的临床症候群,主要表现为尿急,常伴有尿频,伴或不伴急迫性尿失禁,严重影响患者的生活质量和工作效率。对于OAB的首选治疗方式的是行为疗法和抗胆碱能药物治疗。但目前治疗效果并不理想,再加上药物多有明显副作用,患者依从性低,常不能达到治疗要求。神经电刺激治疗主要通过电流刺激周围神经来影响膀胱活动。目前美国FDA已经批准骶神经和胫神经电刺激治疗OAB,此外有研究表明阴部神经电刺激和经皮神经电刺激也可明显改善0AB症状。目前大量文献均支持周围神经电刺激可作为一种安全有效且微创的方案用于难治性OAB的治疗。美国泌尿外科学会指南也推荐TNS和SNM作为顽固性OAB患者的三线治疗方案。然而目前对于神经电刺激作用过程中所涉及的神经通路和神经递质尚不明确。我们课题组的前期研究以短耳猫为实验对象,通过膀胱内灌注低浓度乙酸诱导建立OAB模型,发现胫神经电刺激可明显抑制OAB症状。阿片类受体拮抗剂(Naloxone,1 mg/kg, i.v.)可完全阻断TNS的作用；而TNS与低剂量阿片类受体激动剂(Tramadol, i.v.)联用可明显提高TNS的作用效果。这些结果提示阿片类受体在TNS治疗OAB过程中起重要作用。阿片类受体在调节膀胱收缩方面发挥重要作用：在脊髓水平,脑啡肽能抑制性神经元可抑制膀胱副交感神经传出通路,该效果可被Naloxone阻断；在脊髓上水平,脑室内注射吗啡或内啡肽可抑制膀胱收缩活性；此外,激活脑桥被盖背侧的阿片类受体也可抑制膀胱反射活动。阿片类受体有三个亚型,分别为μ,κ和δ型阿片类受体。不同亚型的阿片类受体在膀胱活动和TNS中的作用可能不同。深入研究三个亚型在TNS中的作用有助于我们进一步理解TNS治疗OAB的作用机制,并为我们开发新的药物或联合治疗提供依据。目的：研究μ,K和δ型阿片类受体在TNS抑制膀胱过度活动中的作用,深入研究TNS抑制OAB的作用机制。方法：1.实验设计：本实验共有22只短耳猫参与实验,根据实验需要分为三组,分别给予选择性μ受体拮抗剂(Cyprodime)、选择性κ受体拮抗剂(Nor-binaltorphimine)和选择性δ受体拮抗剂(Naltrindole),评估各个药物对膀胱活动和胫神经电刺激的影响,以研究μ,κ和δ型阿片类受体在膀胱活动和胫神经电刺激中的作用。异氟烷麻醉后行气管插管保持气道通畅；血氧计固定在舌中部监测心率和血氧饱和度；右侧颈动脉置管监测动物血压；左侧上肢头静脉置管方便静脉给药；结扎双侧输尿管并用橡胶管将尿液引流至体外；于近端尿道向膀胱内插入双腔尿管,导管一侧管腔连接微量灌注泵以向膀胱内灌注液体充盈膀胱,另一管腔连接压力传感器以行膀胱内压力测定。于踝关节上方分离左侧胫神经,并将三极袖状电极置入胫神经周围。2.电刺激参数：根据前期研究结果,本实验中采用单相矩形脉冲电流(5Hz,0.2ms)通过袖状电极刺激胫神经。以开始诱发猫脚趾运动的最小刺激强度作为刺激强度阈值(T)。实验过程中采用2T和4T强度刺激胫神经,来观察胫神经电刺激对OAB的抑制作用及其对不同药物的反应。3.实验过程：在实验开始时,首先向膀胱内灌注生理盐水同时行膀胱内压力测定,当膀胱出现压力大于30cmH20且持续时间长于20秒的收缩时停止灌注,记录膀胱内容量。重复多次直至膀胱容量稳定,即为初始膀胱容量。然后向膀胱内灌注0.25%乙酸诱导建立OAB模型,重复多次直至膀胱容量稳定后进行胫神经电刺激,依次进行如下一组CMG检测：(1)刺激前0.25%乙酸对照,(2)2T-TNS, (3) 4T-TNS,(4)刺激后0.25%乙酸对照,记录不同状态下的膀胱容量。然后根据实验分组分别给予不同药物：第1组动物(n=6)给予累积剂量的Cyprodime (0.003,0.01,0.03,0.1,0.3和1 mg/kg, i.v.);第2组(n=6)给予累积剂量的Nor-binaltorphimine(0.03,0.1,0.3,1.0,3.0和10.0 mg/kg, i. v.);第3组(n=10)给予累积剂量的Naltrindole (0.03,0.1,0.3,1.0,3.0和10.0 mg/kg, i. v.)。每次实验最后都给予非选择性的阿片类受体拮抗剂Naloxone (1mg/kg, i.v.)。每次给药后等待10分钟,然后依次进行一组CMG检测(1)刺激前0.25%乙酸对照,(2)2T-TNS, (3) 4T-TNS,(4)刺激后0.25%乙酸对照。4.数据处理：同一动物每次通过CMG测得的膀胱容量均与初始膀胱容量进行标准化,记录为初始膀胱容量百分比。标准化后可实现不同动物之间数据相互比较,不同动物的统计数据用平均值±标准差来表示。采用Two-way ANOVA分析胫神经电刺激对OAB的抑制作用,One-way ANOVA分析累积剂量的药物的效果。所有统计分析均在GraphPad Prism4.0统计软件中进行,P<0.05认为有统计学意义。结果：1.胫神经电刺激明显抑制膀胱过度活动膀胱内灌注0.25%7,酸后膀胱容量明显降低至初始膀胱容量的21.15±12.21%(P<0.01),提示成功诱导OAB模型。2T或4T胫神经电刺激可明显抑制OAB,明显增加膀胱容量至正常状态的52.92±16.76%和57.39±21.62%(P<0.01)。TNS刺激后膀胱容量与刺激前无明显差异,提示没有刺激后遗效应存在。2.选择性阻断μ,K或δ型阿片类受体对膀胱活动和胫神经电刺激的影响Cyprodime (μ受体拮抗剂)对乙酸对照的膀胱容量没有明显影响,但从0.1mg/kg剂量开始明显降低TNS的抑制作用(P<0.05),在0.3-1 mg/kg剂量时完全消除了TNS的抑制作用。Nor-binaltorphimine(κ受体拮抗剂)从lmg/kg剂量开始明显降低TNS的抑制作用(P<0.05),在3-10 mg/kg剂量时完全消除TNS的抑制作用；但与Cyprodime不同的是nor-binaltorphimine (1-10 mg/kg)明显增加乙酸对照状态下的膀胱容量(P<0.05)。Naltrindole(δ受体拮抗剂)明显增加乙酸对照状态下的膀胱容量(P<0.05)并明显降低TNS的抑制作用(P<0.05),但即使在最大剂量时它也不能完全消除TNS的抑制作用。3.Naloxone的作用Cyprodime处理后,Naloxone(lmg/kg)对乙酸对照和TNS状态下的膀胱容量均无明显影响；Nor-b i nalt orph i mi ne处理后,Naloxone(lmg/kg)明显降低乙酸对照和TNS状态下的膀胱容量,逆转Nor-binaltorphimine引起的膀胱容量的增加；Naltrindole处理后,Naloxone(lmg/kg)对乙酸对照状态下的膀胱容量无明显影响,但可消除残留的TNS的抑制作用。结论：μ和κ型阿片类受体在在胫神经电刺激抑制OAB过程中发挥主要作用,而δ型阿片类受体只发挥微弱的作用。此外,κ和δ型阿片类受体也参与了膀胱过度活动的发生。第二部分不同温度状态对阴部神经传导的影响前言：正常状态下,在储尿期膀胱逼尿肌松弛而尿道括约肌收缩有利于膀胱储存尿液,排尿期膀胱逼尿肌收缩而尿道括约肌舒张有利于尿液排出,膀胱逼尿肌和尿道括约肌协调配合完成整个排尿过程。在某些病理状态下(如脊髓损伤),膀胱和尿道间的协调性消失,在排尿期膀胱逼尿肌和尿道括约肌同时收缩,称为逼尿肌-括约肌失调(DSD)。DSD引起膀胱内高压、排尿困难,长期还导致输尿管反流和肾衰竭,膀胱内大量残余尿和频发导尿也容易引起膀胱内感染和炎症发生。目前针对DSD的治疗主要是间歇性导尿、经尿道括约肌切开术和括约肌内肉毒素A注射,但容易导致永久性尿失禁。局部应用苯酚溶液阻断阴部神经传导也能起到治疗作用。如果可以在排尿时可逆性的阻断阴部神经传导并在排尿完毕后恢复阴部神经传导,即可达到既有效改善排尿又避免永久性尿失禁的目的。神经传导阻断在基础研究和临床治疗中均有广泛的应用,目前有许多方法均可阻断神经传导,归纳起来主要为以下四类：化学药物阻断、手术阻断、电刺激阻断和温度刺激阻断。化学药物阻断神经传导主要包括应用变性药物引起不可逆性轴突损伤从而永久性阻断神经传导,或者应用某种受体拮抗剂可逆性阻断突触传导从而引起可逆性神经阻滞。临床上已经广泛应用局部注射麻醉药物诱导可逆的神经阻滞,但由于难以实现针对神经的慢性长期给药,药物阻滞多用于一过性神经阻滞。手术阻断主要是切断神经来不可逆的阻断神经传导。电刺激包括应用直流或中频电流刺激阻断突触传导或应用高频电流刺激产生局部神经传导障碍。目前临床上有报道应用植入性的高频电流刺激器实现慢性阻断迷走神经来治疗肥胖症或阻断脊髓神经根来治疗疼痛。但高频刺激在实现神经传导阻滞前总会产生一次初始神经发放,可引起神经支配器官的强烈反应或明显痛觉,这也限制了该技术的临床应用。早在上世纪初,就有学者提出可通过改变神经局部温度实现神经传导阻滞。在枪乌贼、牛蛙和猫的体内实验表明,局部46。C以上的高温可阻断神经传导,且温度越高,诱导阻断所需时间越短。但高温阻断的结果难以控制,容易出现过度加热造成神经不可逆性神经损伤。低温刺激(6。C)也可阻断狗阴部神经的传导,而且是可逆性的阻断。但目前将生物体内局部神经温度降至如此低的温度较为困难,需要消耗大量能量,而且长期应用可能损伤周围组织。因此我们需要寻找一种安全有效且简便易行的方法诱导神经传导阻滞,从而用于各种神经反射亢进疾病的治疗。目的：评估不同温度刺激对阴部神经传导的影响,并探索安全有效且简便易行的方法诱导神经传导阻滞。方法：1实验设计异氟烷麻醉后,行气管插管保持气道通畅；血氧计固定在舌中部监测心率和血氧饱和度；右侧颈动脉置管监测动物血压；左侧上肢头静脉置管方便静脉补充液体；结扎双侧输尿管并用橡胶管引流尿液至体外；于近端尿道向尿道内插入双腔导管,一侧管腔连接微量灌注泵以向尿道内灌注生理盐水,另一管腔连接压力传感器测定尿道内压力变化。在尾根部和坐骨切迹之间游离双侧阴部神经并切断中枢端,两侧阴部神经分别进行实验。将阴部神经游离端穿过由细铜管(内径0.36毫米,外径1.57毫米)绕成的铜管圈(长度9毫米,内径2毫米),同时测温探头置于铜管圈内壁与神经之间测定局部温度,铜管圈内壁测温探头和神经表面接触但又不会对神经产生压迫,通过调节铜管中循环水的温度来调节局部神经温度。神经游离端连接钩状电极以间歇性电流(刺激5秒/间隔20秒)刺激阴部神经,正常状态下电刺激通过阴部神经支配尿道括约肌间歇性收缩,表现为间歇性的尿道内压力升高；如果温度变化阻断神经传导,则电刺激时尿道括约肌无反应,尿道内压力无明显变化。最后阴部神经周围皮瓣通过丝线拉起形成小的器官池,其中充满35-37。C的生理盐水以维持恒温环境。2.实验过程本实验共涉及13只短耳猫中的21条阴部神经神经,依次进行如下实验：2.1将局部神经温度依次降低至25、20、15、10、5和20c,每次持续50-60秒,分别观察各个温度状态对神经传导的影响,首次出现完全性神经传阻滞时的温度即为低温阻断阈值；2.2将局部神经温度依次升高至42、44、46、48、50、52和54℃,每次持续50-60秒,分别观察各个温度状态对神经传导的影响,当出现完全性神经传阻滞时停止继续升温,此时的温度即为高温阻断阈值；2.3步骤2中神经经过高温神经阻断后,重复步骤1,观察高温阻断后低温阻断阈值有无变化,若有变化则重复检测低温阻断阈值,直至其恢复到加热前的状态,记录该变化的持续时间；2.4因长时间加热容易引起不可逆性神经阻断,我们还检测不同时间(0.6-3.8分钟)的阈值温度加热后,神经传导的恢复情况,记录引起不可逆性神经阻断需要的加热时间；2.5首先检测初始低温神经阻断阈值,然后升高温度至尚未引起阻断的程度(46-48。C),持续5分钟,然后重复检测低温阻断阈值有无变化,重复加热3次记录其对低温阻断阈值的影响。3数据处理：实验中对阴部神经进行间歇性电刺激,通过检测尿道内压力变化来反映阴部神经的传导情况。将高温或低温刺激时尿道压力幅值标准化为温度变化前尿道压力幅值的百分比,以此来代表高温或低温刺激对神经传导的影响。不同动物的统计数据用平均值±标准差来表示,采用t检验、One-way ANOVA和Two-way ANOVA进行统计学分析,应用GraphPad Prism4.0统计软件完成统计分析,P<0.05认为有统计学意义。结果：间歇性(刺激5秒,间隔20秒)的阴部神经电刺激(50 Hz,0.2 ms,1-10 V)可诱导尿道括约肌间歇性收缩,从而引起尿道内超过40cmH2O的压力变化。手动向铜管内推注冷水/热水可快速降低/升高并维持局部温度,波动在±1℃之间,停止推注后局部温度迅速回复至正常状态。1.降低局部温度时,20℃及以上温度刺激对神经传导无明显影响,15℃开始出现神经阻断。20条神经中,2条神经在15°℃被完全阻断,4条在10℃时被完全阻断,11条在50℃时被完全阻断,另外3条在2°℃被完全阻断,平均阻断温度为6.55±3.83℃。无论是短时间(50-60秒)还是长时间(4-10分钟)低温刺激均不会引起不可逆性神经损伤。2.升高局部温度时,48℃及以下温度刺激对神经传导无明显影响,50℃开始出现神经阻断。检测的14条神经中,2条神经在50°被完全阻断,6条在52℃时被完全阻断,6条在54℃时被完全阻断,平均阻断温度为52.57±1.45℃。局部温度恢复正常后状态后,短时间的神经阻断(1.27±0.44分钟以内)可完全恢复神经传导,而长时间神经阻断(2.74±0.54分钟以上)则引起不可逆性神经损伤。3.短时间阻断性高温刺激对后续低温阻断阈值的影响：部分阴部神经(n=12)依次接收低温阻断、高温阻断然后再次低温阻断。经过短时间阻断性高温刺激后,阴部神经对低温刺激的反应曲线明显右移,即阴部神经对低温刺激的敏感性明显增加。高温刺激前需要平均7.17±1.36℃(2-15℃)的低温刺激才能阻断阴部神经传导；而经过阻断性高温刺激后,平均17.92±1.30℃(10-25℃)的低温刺激即可阻断神经传导。这种影响随时间逐渐消退,即升高的低温阻断温度逐渐降低,最终恢复到初始的水平,这个过程持续42.84±7.00分钟。4.长时间非阻断性局部高温(46-48℃)对后续低温阻断阈值的影响：非阻断性局部高温(46-48℃)也可明显升高后续低温阻断温度,但需要较长时间的加热过程。5分钟的局部高温过程对神经传导没有明显影响,但可明显升高低温阻断温度(6.43±2.44℃vs10.0±2.89℃),重复加热有累积效果,3次重复加热可明显升高低温阻断温度至14.29±4.50℃。结论：本实验证实了局部高温或低温刺激均可诱导阴部神经传导阻滞,并首次发现局部高温可明显提高低温阻断所需的温度。这一发现提供了一种安全有效且方便实现的阻断神经传导的方法,即通过局部高温处理后实现室温(10-25。C)下阻断神经传导。