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燃料乙醇是公认的最有发展前景的可再生清洁能源之一。木质纤维素是地球上最充分的有机资源,以木质纤维素类生物质生产燃料乙醇不仅能够降低燃料乙醇生产的原料成本,同时在废物处理、环境保护等方面起到一定的作用。木糖发酵是植物纤维原料生物转化制取乙醇商业化生产的基础和关键,但自然界存在的微生物菌株不能满足商业化生产的需要。利用基因工程技术对酵母菌进行改造,以提高它们的木糖发酵能力成为目前研究和开发的重点。采用oligo和Primer premier5软件设计引物,从休哈塔假丝酵母中克隆到木糖还原酶基因xyl1,从热带假丝酵母中克隆到木糖醇脱氢酶基因xyl2,从酿酒酵母中扩增到木酮糖激酶基因xks1。对三个基因序列分析表明,它们均不含内含子。以携带酵母菌乙醇脱氢酶启动子(alcohol dehydrogenase promoter,ADHp)和终止子(alcohol dehydrogenase terminator,ADHt)的质粒pGADT7为模板,通过PCR克隆得到ADHp和ADHt。分别将xyl1和xks1与乙醇脱氢酶启动子、终止子重组,使两者置于酵母组织型强表达启动子ADHp的控制下表达,得到ADHp-xyl1-ADHt和ADHp-xks1-ADHt。并将xyl2组入酵母表达载体pMA91磷酸甘油激酶强启动子(phosphoglycerate kinase promoter,PGKp)下,筛选得到正向阳性克隆子,经HindⅢ酶切得到PGKp-xyl2-PGKt。三个基因分别置于PGKp和ADHp控制下表达,使xyl2表达量略高于xyl1、xks1,可以在一定程度上减少木糖醇的积累,增加乙醇产量。以酵母整合型载体Ylp5为出发质粒,分别将ADHp-xyl1-ADHt、PGKp-xyl2-PGKt和ADHp-xks1-ADHt插入到Ylp5的EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ位点,筛选正向阳性克隆子,获得的重组质粒Ylp5-3。本研究成功地构建了携带木糖代谢途径关键酶基因xyl1、xyl2及xks1的重组整合型质粒,为探讨酿酒酵母发酵木糖产乙醇奠定了基础。