【摘 要】
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大丽轮枝菌Verticillium dahliae引致的棉花黄萎病是棉花重大病害之一。大丽轮枝菌具有典型的致病性分化现象,可划分为落叶型和非落叶型两种致病类型。落叶型大丽轮枝菌因引致棉花植株落叶,危害性更大,是我国棉花生产的主要限制因素之一。迄今为止,落叶型大丽轮枝菌引致棉花植株落叶的分子机制相关研究报道甚少。本研究以落叶型菌株XJ592和非落叶型菌株XJ511为研究对象,通过全基因组测序比较分析
【基金项目】
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国家重点研发计划政府间国家科技创新合作重点专项（2018YFE0112500）； 国家自然科学基金（31371888）；
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大丽轮枝菌Verticillium dahliae引致的棉花黄萎病是棉花重大病害之一。大丽轮枝菌具有典型的致病性分化现象,可划分为落叶型和非落叶型两种致病类型。落叶型大丽轮枝菌因引致棉花植株落叶,危害性更大,是我国棉花生产的主要限制因素之一。迄今为止,落叶型大丽轮枝菌引致棉花植株落叶的分子机制相关研究报道甚少。本研究以落叶型菌株XJ592和非落叶型菌株XJ511为研究对象,通过全基因组测序比较分析、基因敲除及互补等方法,研究XJ592菌株引致棉花植株落叶的分子机制。取得了以下主要结果:1.在XJ592引致的棉花植株落叶过程中,植株体内的生长素（AUX）信号途径、茉莉酸（JA）信号途径和细胞分裂素（CTK）信号途径与脱落过程负相关,乙烯（ET）信号途径和水杨酸（SA）信号途径与脱落过程正相关,脱落酸（ABA）信号途径在促进XJ592引致的棉花植株落叶过程中可能更多地起间接作用。XJ592和XJ511侵染棉花植株可以引起ABA和SA含量显著升高,其中XJ592侵染的棉花植株的ABA和SA含量在侵染后第35 d分别为XJ511侵染植株的6.81倍和11.12倍。ET前体物质1-氨基环丙烷羧酸（ACC）含量的测定结果表明,其含量在XJ511侵染植株中与对照植株的没有显著差异,仅在XJ592侵染植株的落叶期显著升高,在侵染后第35 d时ACC含量为XJ511侵染植株的2.17倍。进一步对激素信号通路相关基因定量结果表明,AUX、ET、JA、SA和CTK均参与到大丽轮枝菌侵染引致的落叶过程,其中SA、ET和CTK信号通路相关基因Gh NPR1、Gh EIN4和Gh CKX3（CTK途径负相关基因）在XJ592侵染植株后第35 d表达量分别是XJ511侵染植株的1.75倍、1.92倍和5.24倍;AUX和JA通路相关基因Gh ASA1和Gh MYC2在XJ592侵染植株后第35 d表达量分别是XJ511侵染植株的0.54倍和0.65倍;ABA信号途径相关基因Ghb HLH1的表达模式在XJ592和XJ511侵染植株间没有显著差异。2.通过大丽轮枝菌落叶型菌株XJ592和非落叶型菌株XJ511的全基因组测序、组装、功能注释及比对分析,得到47个XJ592相比于XJ511存在序列差异的分泌蛋白基因。XJ592和XJ511基因组大小分别为35.67 M和34.90 M。XJ592基因组通过预测得到10305个基因,XJ511基因组通过预测得到10462个基因,并得到47个XJ592相比于XJ511存在序列差异的分泌蛋白基因。XJ592和XJ511基因组间存在大量的染色体重排现象并存在47条XJ592独有片段,47条独有片段中有11条为苜蓿轮枝菌或非苜蓿轮枝菌来源,表明基因水平转移现象存在于轮枝菌属不同种之间。3.大丽轮枝菌分泌蛋白Vd SSP、Vd CUE、VdSAP、Vd NCD、Vd CR、Vd NAD和Vd Xyn3参与XJ592侵染并引致棉花植株落叶的过程。根据47个XJ592相比于XJ511存在序列差异分泌蛋白的烟草细胞坏死试验结果及注释信息,选取了Vd SSP、Vd CUE、VdSAP、Vd NCD、Vd CR、Vd NAD和Vd Xyn3共7个分泌蛋白进行了功能验证,发现这7个分泌蛋白的信号肽均具备引导蛋白分泌的功能。基因敲除试验表明它们均参与XJ592引致棉花植株落叶过程。4.大丽轮枝菌利用VdSAP靶向棉花植株的Gh8322X1蛋白,调控植株的防卫反应途径、IDA（Inflorescence Deficient in Abscission）介导的脱落信号途径和ET信号途径,成功实现侵染并引致植株落叶。酵母双杂试验、双分子荧光互补试验、MBP pull-down试验和Co-IP试验结果表明,VdSAP与Gh8322X1存在互作关系。沉默Gh8322X1基因后,XJ592侵染植株的病情指数和落叶率分别为89.44和82.2%,相比于未沉默植株分别提高了20.1%和24.4%。Gh8322X1蛋白在烟草叶片细胞瞬时表达后会显著促进SA、JA、ET和PTI（Pattern-Triggered Immunity）介导的防卫反应,抑制植物IDA介导的脱落信号途径,表明Gh8322X1负向调控棉花植株的落叶过程,且在植物防卫反应和生长发育过程中发挥着分子纽带作用。此外,通过VdSAP和Gh8322X1蛋白体外孵育和体内共表达试验结果表明,VdSAP负向调控Gh8322X1的蛋白水平。Gh8322X1基因沉默植株的定量结果表明,Gh8322X1的抑制会显著促进棉花植株ET信号途径表达。因此,在落叶型大丽轮枝菌侵染棉花植株并引致落叶的过程中,ET信号途径发挥着关键作用。落叶型大丽轮枝菌分泌VdSAP靶向棉花植株的Gh8322X1蛋白并促进其降解,进而导致棉花植株ET信号途径和IDA介导的植物脱落信号途径受到显著诱导,最终促进棉花植株发病和叶片脱落。
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