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控制癫痫发作始终是癫痫治疗的关键环节,但癫痫发作后神经元损伤、胶质细胞增生、苔藓纤维发芽(MFS)等加重兴奋性异常网络形成也不容忽视。神经元损伤既是癫痫发作的结果也是癫痫再发和难治性癫痫形成的原因。尽管国内外学者在癫痫频繁发作及癫痫持续状态后神经元损伤方面做了大量工作,对损伤机制有一定认识,但具体机制、如何应对尚无定论。故而如何减轻癫痫发作后神经元损伤,防治癫痫进展与控制癫痫发作同样重要。本研究以验证miR-182、miR-124和APLN之间的关系为前提,探讨APLN在癫痫发生以及对癫痫发作后神经元损伤的调控机制,从而为减轻癫痫发作后神经元损伤、防治癫痫进展奠定理论基础。第一部分miR-182和miR-124靶基因预测及初步鉴定目的:1、根据miRNAs靶基因生物信息数据库分析,预测miR-124和miR-182的靶基因。2、研究miRNA-182/124、APLN在癫痫患者和正常人血液中的差异表达;分析癫痫患者与正常患者中miR-182/124和APLN的相关性。方法:1、通过生物信息学软件可以对miRNAs的靶基因进行预测,经Target Scan、NCBI、miRbase、micrriorna.org等多个生物信息学软件预测后综合分析结果。2、随机选择癫痫患者30例,健康对照组30例,采集肘部静脉血5ml左右;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测miRNA-182/124、APLN在癫痫患者和健康人血液中的表达差异。结果:1、根据miRNAs靶基因生物信息数据库分析结果,选择miR-124和miR-182的共有靶基因APLN为预测靶基因。2、通过q-PCR技术检测,我们发现miR-124在癫痫患者中表达量显著低于对照组(P<0.05);miR-182在癫痫组也体现同样的表达趋势,在癫痫患者中表达量低于对照组(P<0.05);然而APLN基因在癫痫患者中显著高于正常组,并且差异为倍数表现极为显著(p<0.01)。总体趋势,在癫痫组和对照组组均可见到mir-124、mir-182表达量同apln基因呈负相关表达趋势。结论:1、根据mirnas靶基因生物信息数据库分析,预测apln可能是mir-124和mir-182的靶基因之一。2、与健康人群相比,癫痫患者外周血中存在mir-182、mir-124和apln的差异表达,表明mir-182、mir-124和apln可能参与癫痫的发生和发展,为进一步研究mir-182/124-apln对癫痫的调控机制奠定基础。第二部分mir-182和mir-124与预测靶基因apln靶标关系验证目的:构建mir-182/124表达载体和双荧光素酶报告基因载体;应用各种实验验证mir182/124与apln之间的关系及mir182/124对细胞凋亡的影响。方法:1、通过mirbase数据库分别设计了mir-124-3p和mir-182-5p的过表达载体和干扰载体。再利用ucsc数据库和ncbi数据库设计双荧光素酶报告基因载体。2、应用双荧光素酶报告基因检测mir182/124-与靶基因apln荧光素酶活性。3、应用qpcr、westernblot技术验证mir182/124与apln在基因和蛋白水平的关系。4、应用流式细胞仪检测mir182/124对神经元细胞凋亡的影响,应用westernblot技术检测mir182/124过表达和干扰载体中凋亡相关基因bax、casepase-3和bcl-2蛋白表达变化。结果:1、成功构建mir-182/124mimics,inhibitor,mir-shnc表达载体及构建了双荧光素酶报告基因载体:mir-182-apln-wt(野生型识别序列为ttgccaa)、mir-182-apln-mut(突变型识别序列为catgtag)、mir-124-apln-wt(识别序列为gtgcctt)和mir-124-apln-mut(识别序列为catgtag)。2、通过双荧光素酶报告基因系统检测,我们发现mir-182和mir-124mimics分别与apln基因野生型、突变型、空载等三种报告载体进行共转染后,荧光素酶活性检测结果显示,mir-124+apln-wt组的荧光素酶活性低于mir-124+apln-mut共转染组和mir-124+si组,但不显著;而mir-182+apln-wt组荧光素酶活性与它两组相比显著降低(p<0.05),mir-182+apln-mut组和mir-182+si组酶活性差异不明显。3、通过实施荧光定量检测发现,mir-182在mir-182mimics组表达量显著高于mir-182inhibitor组(p<0.01),说明mir-182成功的在大鼠神经元细胞中进行了过表达和干扰;而apln基因在mir-182mimics组显著低于mir-182inhibitor组(p<0.01),总体而言,mir-182在mrna水平上抑制apln基因的表达。与此同时,mir-124在mir-124mimics组表达量也显著高于mir-124inhibitor组(p<0.01),mir-124成功进行了过表达和干扰。但是apln基因和mir-124的表达量呈现相似的趋势,并无负相关。利用westernblot技术发现,mir-182过表达后apln蛋白表达量明显低于mir-182被沉默后的表达量。但是mir-124过表达后,apln蛋白表达量并无显著的下调趋势,而是呈现相对最高的表达量。4、流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,神经细胞转染mir-182mimics、mir-182inhibitor和mir-shnc细胞凋亡率分别为19.09%、14.01%和17.6%;转染mir-124mimics、mir-124inhibitor和mir-shnc的细胞凋亡率分别为18.77%、13.83%和17.44%。5、westernblot实验中:casepase-3、bax蛋白表达量在mir-182/124mimics、mir-182/124inhibitor、mir-shnc及control组中呈下降趋势;而bcl-2蛋白表达量在各组转染细胞中大致呈上升趋势。结论:1、mir-182与apln之间存在靶标关系。mir-124同样能与apelin有结合,但可能结合的并不牢固。2、mir-182可以在mrna和蛋白水平上抑制apln表达;但mir-124并不能直接调控apln基因的表达水平。3、mir-182/124均能够促进神经细胞的凋亡,还可抑制bcl-2的蛋白表达量,上调bax和caspase-3的蛋白表达量;但mir-124可能通过apln外的其他介质进行调控。第三部分apln对癫痫发作后神经元保护作用体内、外机制研究目的:1、建立癫痫细胞模型、动物模型。2、研究apln在癫痫发生发展过程中的作用机理。3、进一步探讨mir-182-apln在癫痫发作后的调控机制。方法:1、无镁细胞外液建立海马神经元癫痫细胞模型并培养细胞;向癫痫细胞中分别转染pbi-cmv3-apln过表达载体、空载、mir-182mimics(mir-182模拟物)载体和aplnshrna(干扰apln)载体;应用流式细胞术检测上述各载体中海马神经元凋亡率。2、建立ptz诱发癫痫大鼠模型,向体内注入apln过表达质粒、apln沉默质粒、mir-182mimics质粒及对照质粒;通过q-pcr检测海马组织中mrna表达。3、在癫痫体内、外模型中,应用westernblot检测过表达和沉默apln对谷氨酸受体1(mglur1)及对细胞凋亡相关因子bax、caspase-3、bcl-2、p-akt的调控作用。结果:1、向大鼠海马神经元癫痫细胞模型中分别转染pbi-cmv3-apln过表达载体、空载、mir-182mimics和aplnshrna载体,各载体可以在大鼠神经元中高效表达,证明转载成功。转染后48h,流式细胞术检测大鼠海马神经元凋亡水平的变化。结果显示,转染pbi-cmv3-apln过表达载体、空载、mir-182mimics和aplnshrna细胞凋亡水平分别为4.00%、15.55%、17.90%、18.89%,结果表明apln可显著抑制细胞凋亡。2、观察癫痫大鼠模型行为学改变,成功建立点燃模型36只,随机分为4组注入上述不同质粒后,通过q-pcr检测apln基因在海马组织中的表达量发现,apln过表达组成功的在大鼠海马组织进行了人为干预的上调表达;而在apln沉默组和mir-182过表达组,apln的表达量低于未受干涉的癫痫大鼠海马组织,但apln沉默组与mir-182过表达组无明显差异。3、向癫痫细胞模型转染PBI-CMV3-APLN过表达载体、空载、miR-182 mimics和APLN shRNA载体48h后,Western blot检测结果显示:mGluR1蛋白在APLN过表达组<shNC<miR-182 mimics<APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-B);p-AKT-PBI-CMV3-APLN过表达组>shNC>miR-182 mimics>APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-C);Bax-PBI-CMV3-APLN过表达组<shNC<miR-182mimics<APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-D);Caspase3-PBI-CMV3-APLN过表达组<shNC<miR-182 mimics<APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-E);Bcl-2-PBI-CMV3-APLN过表达组>shNC>miR-182 mimics>APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-F);4、对癫痫大鼠海马组织进行Western blot检测显示:细胞存活促进因子Bcl-2蛋白在APLN过表达组、shNC对照组、miR-182 mimics组、APLN shRNA组总体呈现下调表达趋势;而过表达miR-182 mimics组和APLN沉默组相比,Bcl-2蛋白表达量相差不明显。但是促进细胞凋亡基因Bax、细胞凋亡执行因子Caspase3、代谢型谷氨酸受体1(mGluR1)依上述载体顺序总体呈现上调表达趋势。结论:1、体内、外癫痫模型实验均证实,APLN抑制mGluR1,可减少神经细胞毒性造成的神经细胞损伤,并可降低神经兴奋性缓解癫痫发作。APLN可能通过PI3K/p-Akt途径发挥抗凋亡神经保护作用。APLN还下调Bax、Caspase-3促凋亡因子的表达,上调Bcl-2抑凋亡因子的表达减少细胞凋亡所引起的神经元损害,对癫痫发作后神经损伤起到保护作用。2、推测miR-182能通过下调靶基因APLN的表达,加重癫痫后神经细胞损伤,反之,抑制miR-182可上调APLN表达,从而对癫痫发作后神经元损伤起到保护作用,可能成为未来癫痫发作后神经元保护治疗途径。